材料和试剂

丁腈手套＆nbsp;
低保留移液器吸头（VWR，目录号：89187-848,89079-476和89079-486）
PEI Cellulose F TLC板（Millipore，目录号：105579）
0.65 ml Microcentrifuge Tubes（VWR，目录号：87003-290）＆nbsp;
保鲜膜＆nbsp;
软铅笔＆nbsp;
永久性标记
无菌0.22μmPVDF注射式过滤器（赛多利斯，目录号：17761-Q）
用于收集 32 P污染移液器吸头和管的容器（VWR，目录号：13915-114）
牛血清白蛋白（BSA）（赛默飞世尔科技，目录号：23209）
二硫苏糖醇（DTT）（Gold Bio，目录号：DTT100）
12％SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad，目录号：4561046）
BLUEstain Protein Ladder（Gold Bio，目录号：P007-500）
三磷酸腺苷（ATP）（西格玛奥德里奇，目录号：A2383）
Ethylenediaminetetraacetic acid（EDTA）Disodium，dehydrate（Gold Bio，目录号：E-210-1）
Tris-HCl（VWR Life Science，目录号：77-86-1）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：7647-14-5）
SDS（Ameresco，目录号：M107-500G）
NaN 3 （Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
甘氨酸（VWR生命科学，目录号：56-40-6）
乙酸（Pharmco AAPER，目录号：281000ACSCSLTGL）
甲醇（Fischer Chemical，目录号：67-56-1）
考马斯蓝R250（Gold Bio，目录号：C-461-100）
氯化镁（MgCl 2 ）无水（Ameresco，目录号：J364-500G）
α- 32 P ATP（PerkinElmer，目录号：BLU003H250UC）
单磷酸钾（K 2 HPO 4 ）（VWR Life Science，目录号：0781-1KG）
溴酚蓝
甘油
Milli-Q水
氢氧化钠
1M MgCl 2
3x SDS样品缓冲液（参见食谱）
SDS运行缓冲区（参见食谱）
总蛋白SDS-PAGE凝胶染色（见食谱）
SDS-PAGE凝胶去污（见食谱）
Spa47缓冲区（见食谱）
ATP反应混合物（见食谱）
单磷酸钾（K 2 HPO 4 ）缓冲液（见食谱）＆nbsp;
0.5 M EDTA，pH 7.9（见食谱）

注意：许多这些试剂都是危险的。在执行本协议之前，请熟悉每种化学品的潜在危害。

设备

标尺＆NBSP;
定时器＆NBSP;
微量离心管架
热循环仪
摇摆平台
-20°C冰柜
用于SDS-PAGE的电泳系统和模块（Bio-Rad，目录号：125BR）
电泳电源（Bio-Rad，型号：PowerPac 300）
可调式移液器（Eppendorf，产品目录号：3120000011,3120000020,3120000046,3120000038和3120000062）
凝胶成像仪（Bio-Rad Chemi Doc MP成像系统）
分光光度计（Thermo Spectronic，型号：Genesys 10 UV）
指定（核准）放射性工作的空间
辐射防护罩（Nalgene，目录号：6700-1812）
盖革计数器（Technical Associates，型号：TBM-15）
Vortexer mini（VWR，目录号：58816-121）
TLC显影槽（Sigma-Aldrich，目录号：Z126195-1EA）
存储荧光屏（柯达，型号：SO230）
STORM 860扫描仪（Molecular Dynamics）

软件

Image Lab Software 5.2.1（Bio-Rad Laboratories）
Image Quant 5.1（分子动力学）＆nbsp;
Microsoft Excel（微软）
Sigma Plot 12（Systat软件）
ImageJ的
STORM扫描仪控制软件

程序

第1天

Spa47可以使用以前公布的方法纯化（Burgess et al。，2016b）。通过凝胶光密度测定法或其他适当方法测定Spa47的浓度，以获得具有低A 280 消光系数的蛋白质。（Spa47不含任何色氨酸残基，A 280 消光系数极低，但A 280 的蛋白质浓度测定可用于大多数其他蛋白质） /> 注意：净化后，Spa47位于“Spa47缓冲液”（食谱5）中。
1. 通过在Spa47缓冲液中稀释经认证的2.0 mg / ml标准品制备BSA标准品（0.025,0.05,0.1,0.25,0.5 mg / ml）。通过添加3x SDS样品缓冲液和DTT（20μl蛋白质样品，10μl3xSDS样品缓冲液，1μl1.5MDTT），在0.65ml微量离心管中制备每种BSA标准品和未知浓度的Spa47溶液。使用热循环仪将所有样品加热至99°C 10分钟。
2. 在12％SDS-PAGE凝胶的孔中加载1μl蛋白质梯度和10μl每种BSA标准品和未知浓度蛋白质样品。在180V下进行分离，直到SDS样品缓冲液中的蓝色染料前端到达凝胶板的底部（约60分钟）。
3. 从凝胶板上取下凝胶，并在摇动平台上将其置于总蛋白SDS-PAGE凝胶染色溶液中30分钟。在摇动平台上将凝胶移至SDS-PAGE凝胶去污溶液中1-2小时，或直至凝胶均匀且完全去除污渍。这可能需要在去污过程中将去污溶液改变一次或两次。
4. 使用设置为落射照射的Bio-Rad Chemi Doc MP成像系统对染色的凝胶成像。使用相关Image实验室软件中体积工具菜单中的矩形选择工具，在每个BSA标准和Spa47样品中绘制蛋白质条带周围的框。在图像的一个区域中包含一个不含任何蛋白质的附加框，并将其设置为代表凝胶中的全局背景信号。打开分析表以显示BSA标准的“调整后的体积”（背景扣除强度）。绘制调整后的体积与BSA标准品的已知浓度，并将数据点拟合为线性标准曲线。线性标准曲线应导致R 2 ≥0.98，然后使用拟合方程确定Spa47的浓度（参见图1）。或者，蛋白质密度测定分析可以用开源软件如ImageJ进行。
  注意：在我们的手中，典型的单体Spa47浓度为9μM，典型的低聚Spa47浓度为3μM。最高水平的Spa47 ATP酶重现性来自≥95％的纯重组蛋白。
  
  图1.使用Image Lab和BSA标准品的凝胶光密度测定法测定Spa47的浓度
准备ATP的储备溶液
1. 在Milli-Q水中溶解ATP，目标浓度为100 mM（55.114 mg ATP / ml）。＆nbsp;
2. 用无菌的0.22μmPVDF注射器过滤器过滤新制备的储备ATP溶液，并制备3个单独的1至10,000稀释的储备ATP。使用Genesys 10UV分光光度计测量每种溶液在259nm处的吸光度。
3. 使用ATP的消光系数（15×10 3 M -1 cm -1 ）来确定每种稀释的ATP溶液的浓度。确定三者的平均浓度，并将其记录为原液ATP溶液的浓度（确保三次测量彼此良好一致）。如果储存在-20°C并且等分以避免冻/融循环，ATP储存可以长期储存。
准备TLC板
使用标尺测量并将20×20cm的Millipore TLC板切成两半。在10厘米的一侧测量1厘米，并在板上轻轻画一条铅笔线。在整条线上以1厘米的间隔放置刻度线。
注意：必须使用软铅笔轻轻擦拭，以免刮掉TLC板上的固定相。如果固定相损坏，请勿使用平板。
设置0.65 ml微量离心管，如图2所示
1. 将7.5μl0.5MEDTA移液到每个用于反应的“时间点管”以及“背景猝灭剂”管中。用适当的时间点标记这些试管，并收集蛋白质条件/ ATP浓度。＆nbsp;
2. 向反应管中加入适量的Spa47和Spa47缓冲液，在最终75μl反应体积中达到最终浓度为0.5μM的Spa47（此体积最多可保留9个时间点）。
  注意：重要的是要注意，因为您将在每个试管中加入7.5μlATPMix以引发反应，我们希望反应中最终的Spa47浓度为0.5μM，试管中应含有67.5μl的0.555添加ATP之前的μMSpa47。
3. 通过向管中添加67.5μl的Spa47缓冲液并使用7.5μl的0.5M EDTA制备相应的背景猝灭剂管来制备背景样品。
  注意：如果您在多个ATP浓度下进行分析，则必须为实验中使用的每种ATP浓度制作背景管。
图2.α - 32 P ATP ATP酶活性测定的试管设置
在指定用于处理放射性物质的区域内，在适当的辐射防护罩后面进行ATP反应混合（参见食谱）。
注意：如果您在多个ATP浓度下进行动力学分析，则需要进行连续稀释以产生ATP反应混合溶液，这将导致所需的最终ATP浓度。另请注意，混合物含有放射性α- 32 P ATP，应小心处理。
ATP酶活性测定
1. 从图2所示的设置开始，在适当的辐射防护罩后面工作并打开所有管。启动计时器，同时向反应管中加入7.5μlATP反应混合物以引发反应。快速关闭反应管并短暂涡旋。重新打开管。
2. 从反应管中取出7.5μl酶反应物，并在预定时间点将其加入含有7.5μl0.5MEDTA的时间点管中的一个中止。在适当的时间点重复该步骤，直到收集到所有期望的时间点并且完成所有期望的反应条件。
  注意：以0.5μM测定的单体Spa47的常见时间点包括1,5,10,15和30分钟，而0.5μM的寡聚Spa47的常见时间点包括1,2.5,5,10和15分钟。 / EM>
3. 向背景管中加入7.5μl反应混合物（不含酶），关闭并涡旋该管。从背景管中取出7.5μl并在含有7.5μl0.5MEDTA的背景猝灭管中淬灭。
  注意：此步骤可以在分析期间或之后直接进行。
在TLC板上分开反应
1. 从每个时间点吸取1μl猝灭反应到TLC板上（将溶液直接移液到水平线和垂直“刻度线”的交点上，然后在TLC板上绘制（步骤3）（见图3）。发现背景一式三份。
  
  图3.分离α - 32 P ATP和/或α - 32 < / strong> P ADP。 A.在TLC板上点样淬灭的Spa47反应样品的布局（虚线圆圈显示在哪里发现1μl样品）。 B.还包括缓冲室中斑点TLC板的一个例子。
2. 让TLC板上的斑点干燥，然后将板放入含有足够的单磷酸钾缓冲液（参见配方）的缓冲室中以覆盖室底部，但不要太多以至于它与斑点蛋白样品的位置接触。
3. 将TLC板留在腔室中，直到流动相芯吸到TLC板的顶部。从腔室中取出TLC板，使其在通风橱中干燥。
  注意：该板现在含有放射性α- 32 P ATP和α- 32 P ADP。
4. 干燥后，将TLC板包裹在塑料包装中，并在存储荧光屏中暴露过夜（约8小时）。

第2天

成像存储荧光屏
取下TLC板并将存储荧光屏放在Molecular Dynamics STORM 860扫描仪上。打开STORM扫描仪控制软件并使用以下设置对屏幕成像：635 nm激发，390 nm发射和200微米像素大小。
量化ATP和ADP浓度
1. 使用Molecular Dynamics ImageQuant软件打开存储荧光屏的凝胶STORM图像文件。使用ImageQuant中的选择工具，在最大的ATP点附近绘制一个框，如图4所示。在每个ATP和ADP点周围复制并粘贴相同的框，以确保每个框的大小完全相同。
  注意：图像对比度可以增加，更容易看到图像中的微弱点，这不会影响下游定量。
2. 在ImageQuant的“分析”菜单下，生成卷报告并将强度导出到Microsoft Excel进行数据分析。
  
  图4.使用TLC分离的α 32 P ATP和α- 32 P ADP 的ImageQuant分析确定ATP水解速率>

数据分析

使用来自磷光体扫描的α- 32 P ATP和α- 32 P ADP斑点的体积，可以对Spa47s转化为ADP进行定量分析。存储屏幕如图3所示。使用ImageQuant输出的体积，将每个反应时间点的ADP体积除以该时间点的ADP + ATP体积，再乘以原始反应条件下ATP的总浓度（在这种情况下为1 mM）。这样，您可以在乘以上一步中的总ATP浓度时，以您使用的单位表示ADP浓度。对背景点做同样的操作，如图4所示。因为在背景反应条件下没有酶，所以很可能检测到的ADP非常少，因此在放置盒子时可能需要使用最佳判断。磷光体存储屏幕上的相应ADP斑点。现在，从每个反应时间点确定的ADP浓度中减去平均背景（点样并一式三份计算）。这些值代表在每个反应时间点形成的背景扣除的ADP浓度。绘制这些浓度与反应时间的关系将允许您从拟合线性回归线的斜率确定V 0 （图4）。
＆NBSP;通常，有必要表征酶的底物浓度依赖性，并且这可以通过简单地在反应中以多个起始ATP浓度重复上述步骤来实现。如图5所示，可以绘制由多个ATP浓度产生的每条线的斜率与相应的ATP浓度的关系。重要的是要注意底物浓度将对每个反应的初始速度产生显着影响。以及达到反应饱和所需的时间。您可以在图5的图表中看到，由于在较长时间点失去线性，因此允许具有最低ATP浓度（25μM和50μM）的反应进行的时间比其他反应短得多。然后使用SigmaPlot（公式1）将[ATP]与初始速度（μmolADP/ s）的关系曲线拟合到Michaelis Menten方程。

＆NBSP;根据Michaelis Menten拟合，酶在测试条件下可达到的最大速度（V max ），底物浓度导致一半V max （K <确定sub> M 。这允许通过将k max 除以总酶浓度和酶的特异性常数，通过将k cat 除以K来计算k cat <子>中号。然后应重复每个反应条件以允许稳健的统计分析。
注意：任何ATP酶的反应速率可以如上所述确定，但描述的方法用于测定动力学参数V max ，K M ，k cat ，特异性常数要求酶遵循Michaelis Menten动力学。

图5.不同ATP浓度下Spa47的非线性动力学分析示例 A.不同ATP浓度下ATP水解速率。 B.Michaelis-Menten图显示了Michaelis常数（K M ）和酶可达到的最大速度（V max ）。

食谱

3x SDS样品缓冲液（400 ml）
210mM Tris-HCl（pH6.8）
100 mM NaCl
3 M EDTA
200 mM SDS
3 mM NaN 3
0.03％溴酚蓝
30％甘油
SDS运行缓冲区
20 mM Tris-HCl
200 mM甘氨酸
3.5mM SDS
总蛋白SDS-PAGE凝胶染色
10％醋酸
40％甲醇
2 mM考马斯蓝R250
50％H 2 O.
SDS-PAGE凝胶脱色
10％醋酸
40％甲醇
50％H 2 O.
Spa47缓冲区
20 mM Tris-HCl
100 mM NaCl
5 mM DTT
用6 M HCl将pH调节至7.9
ATP反应混合物
10 mM ATP
120mM MgCl 2
0.5μCi（~300nM）α- 32 P-ATP
单磷酸钾（K 2 HPO 4 ）缓冲液
0.6 M K 2 HPO 4
用HCl调节pH至3.4
0.5M EDTA，pH7.9
0.5 M EDTA
加入NaOH颗粒直至EDTA完全溶解，用6 M HCl将pH调节至7.9

致谢

这里介绍的工作部分得到了美国国立卫生研究院资助1R15AI124108-01A1和R. Gaurth Hansen捐赠资金给N.E D.的支持。

利益争夺

作者声明没有财务或非财务竞争。

参考

Baykov，A.A.，Evtushenko，O。A.和Avaeva，S。M.（1988）。用于正磷酸盐测定的孔雀石绿方法及其在基于碱性磷酸酶的酶免疫测定中的应用。 Anal Biochem 171（2）：266-270。
Burgess，J.L.，Burgess，R.A.，Morales，Y.，Bouvang，J.M.，Johnson，S.J。和Dickenson，N.E。（2016a）。 Spa47的结构和生化特征提供了对III型分泌系统ATP酶活化和志贺氏菌的机制见解毒力调节。 J Biol Chem 291（50）：25837-25852。＆nbsp;
Burgess，J.L.，Jones，H.B.，Kumar，P.，Toth，R.T。t。，Middaugh，C.R.，Antony，E。和Dickenson，N.E。（2016b）。 Spa47是来自福氏志贺菌的寡聚化激活型三分泌系统（T3SS）ATP酶< / em>。 Protein Sci 25 1037-1048。
Case，H.B。和Dickenson，N。E.（2018）。 MxiN差异调节志贺氏菌三型分泌系统的单体和寡聚物种ATPase Spa47。 Biochemistry 57（15）：2266-2277。＆nbsp;
Hoskins，J.R.，Wickner，S。和Doyle，S.M。（2018）。细菌Hsp90 ATP酶检测。方法Mol Biol 1709： 199-207。
King，S.M。（1995）。第21章使用[γ- 32 P] ATP测量ATP酶活性。：Dentler，W。和Witman，G。（编辑）。细胞生物学方法。学术出版社。第141-145页。
Li，C.，Numata，M.，Takeuchi，M。和Shinkai，S。（2005）。基于聚噻吩衍生物的敏感比色和荧光探针，用于检测ATP。 Angew Chem Int Ed Engl 44（39）：6371-6374。＆nbsp;
Miller，J。M.和Enemark，E。J.（2016）。 AAA +蛋白质家族结构和功能的基本特征。 Archaea 2016：9294307。＆nbsp;
Sauer，R。T.和Baker，T.A。（2011）。 AAA +蛋白酶：以ATP为燃料的蛋白质破坏机器。 Annu Rev Biochem 80：587-612。＆nbsp;
Sehgal，P.，Olesen，C。和Moller，J。V.（2016）。通过酶偶联分光光度法测定ATP酶活性。方法Mol Biol 1377：105-109。＆nbsp;
Stock，D.，Gibbons，C.，Arechaga，I.，Leslie，A.G。和Walker，J.E。（2000）。 ATP合成酶的旋转机制。 Curr Opin Struct Biol 10（6）：672-679。
Soyenkoff，B。（1947）。确定磷酸盐的微量方法。 J Biol Chem 168 （2）：447-457。