材料和试剂

9.2cm 2（40mm直径）组织培养皿（TPP，由Sigma-Aldrich提供，目录号：93040）
手套
0.2μm注射器过滤器
3槽网格（Ted Pella，目录号：01816）（图1）

图1. 3个插槽网格
APEX2-csGBP载体（Addgene，目录号：108874）（-20°C以下保管）
mKate2-P2A-APEX2-csGBP载体（Addgene，目录号：108875）（-20°C以下保管）
APEX2-csChBP载体（Addgene，目录号：108876）（-20°C保存）
EGFP-P2A-APEX2-csChBP载体（Addgene，目录号：108877）（-20°C保存）
带有选择插入片段的mVenus-N载体克隆到EcoRV / SpeI（Addgene，目录号：108887）（-20°C储存）
带有选择插入片段的mVenus-C载体克隆到EcoRV / SpeI（Addgene，目录号：108888）（-20°C储存）
Lipofectamine 3000（Life Technologies，目录号：L3000015）（在4°C下储存）
牛血红素（Sigma-Aldrich，目录号：H9039）（4°C储存）
3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）（Sigma-Aldrich，目录号：D4168）（储存于-20°C）
戊二醛（电子显微镜科学，目录号：16220）（在4°C下储存）
过氧化氢（Sigma-Aldrich，目录号：H1009）（储存于4°C）
四氧化锇（OsO 4）（ProSciTech，目录号：C010）（储存于4°C）。具有剧毒和腐蚀性。
LX112树脂套件（Ladd Research，目录号：21310）（组成时保存在-20°C）
二甲胂酸钠三水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C0250）（储存于4°C）
乙醇（化学供应，目录号：EA043-2.5L-P）＆nbsp;
盐酸32％（RCI，目录号：RP1104）
氢氧化钠
氯化钾
娜<子> 2 HPO <子> 4
KH <子> 2 PO <子> 4
氯化钠
牛血红素（必要时）（见食谱）
PBS，pH 7.4（参见食谱）
0.1％二甲胂酸盐缓冲液中2.5％戊二醛（见食谱）
0.2 M二甲胂酸盐缓冲液（见食谱）
DAB / Cacodylate洗涤混合物和DAB /二甲胂酸盐反应混合物（见食谱）
四氧化锇溶液（见食谱）
用于脱水的乙醇系列（参见食谱）
LX112树脂乙醇系列（见食谱）

设备

钳子（JBS，目录号：00718811）或类似物
烤箱（SEM，型号：24）或类似
PELCO Biowave采用PELCO ColdSpot Pro系统进行温度控制（Ted Pella）（图2）

图2. PELCO Biowave
JEM-1011透射电子显微镜（JEOL）或类似产品
Leica EM UC6 Ultramicrotome（Leica Microsystems）或类似产品
Morada CCD相机（Olympus Soft-Imaging-Solutions）或类似产品（图3）

图3. JEM-1011电子显微镜（左），Leica EM U6 Ultramicrotome（中），Morada CCD相机（右）
45°金刚石刀（硅藻土，由Agar Scientific提供，目录号：AGG339-5）（图4）

图4. 45°钻石刀
项目特定的组织培养设备，如II类生物安全柜，CO 2培养箱等。
通风柜
涡旋

软件

iTEM（EMSIS GmbH）v5.2，版本4768，需要许可证， https：//www.emsis。欧盟/产品/软件/项
Photoshop CC（Adobe），需要许可证， https://www.adobe.com/au/creativecloud。 HTML

程序

胰蛋白酶消化后，将细胞接种到TPP培养皿上，在转染时达到60％-90％的汇合（图5）。

图5.程序的时间表。整个过程通常需要四天，包括转染后的过夜孵育。在高表达细胞系如BHK（我们最常用的细胞系）中，通过减少转染后孵育步骤可将其缩短至3天。表达水平可以通过荧光凭经验确定。
使用Lipofectamine 3000以1：1比例的编码cs-纳米抗体-APEX（Addgene 108874或108876）的质粒进行转染，并根据需要与以下一起进行;编码GFP-或mCherry-标记的目的蛋白质的质粒;编码推定的目的相互作用蛋白质的质粒与裂解GFP的N-或C-末端构建体融合;适当的对照质粒。为了控制非特异性APEX标记，我们至少使用一半分裂GFP对（N或C）与APEX-csGBP质粒。额外的控制可以是i）没有转染; ii）仅限APEX-csGBP; iii）已知的不相互作用的蛋白质; iv）感兴趣的蛋白质与相互作用的结构域通过诱变而变得无功能（如果该信息是已知的，则这是理想的对照）。每3cm培养皿使用1微克每种质粒作为标准。
孵育3小时，然后更换培养基。再孵育24小时。注意，某些细胞类型需要添加外源血红素以获得最大的APEX活性。如果需要，在固定前加入牛血红素至终浓度为7μM16小时或更长时间。
从细胞中取出培养基，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤3次，每次2分钟（注意所有洗涤液每皿3ml）。在0.1M二甲胂酸盐缓冲液中，在室温下固定2.5％戊二醛30分钟。在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中洗涤三次（在室温下各5分钟）。固定后立即进行DAB反应至关重要。应在固定期间制备DAB /二甲胂酸酯反应和洗涤混合物。
在DAB /二甲胂酸盐洗涤混合物中洗涤2分钟。用DAB /二甲胂酸盐反应混合物（含有过氧化氢）代替，并在室温下孵育30分钟。用0.1M二甲胂酸钠洗涤3次，每次5分钟以除去游离的DAB。
在四氧化锇溶液中后固定2分钟以将DAB反应产物转化为电子致密染色。在0.1M二甲胂酸盐缓冲液中各洗涤3次，每次2分钟，再在双蒸H 2 O中洗涤3次。
在装配有PELCO ColdSpot Pro系统的PELCO BioWave中以250W（在30％乙醇中孵育40秒，然后50％，70％，90％和2×100％），用增加浓度的乙醇进行连续脱水。
在Biowave中，在250W真空下，逐步增加浓度（25％，50％，75％和2×100％）LX112树脂在乙醇中的渗透3分钟。
注意：脱水和渗透步骤可以在不使用微波的情况下进行，每次脱水步骤增加至10分钟，树脂浸润步骤至60分钟孵育，过夜孵育最后100％步骤。
在60℃下聚合16-24小时。用钳子将塑料组织培养皿与树脂包埋细胞分开，并准备用于切片的块（图6）。

图6.将块中的树脂嵌入细胞与塑料组织培养皿（A）分离并安装在切片机夹头（B）中
使用ultramicrotome和45°金刚石刀切割60 nm切片。将部分放在EM网格上（例如，formvar和碳涂层三槽网格）。
在电子显微镜下在80kV下的图像，从低放大率（~x200）开始，以在引入物镜孔径之前找到感兴趣的区域并且根据需要逐渐移动到更高的放大率。有关染色的示例，请参阅Ariotti et al。（2015）。

笔记

条件稳定的纳米抗体在其不存在结合配偶体的情况下的降解依赖于有效的蛋白酶体降解。已知蛋白酶体降解的效率因细胞类型而异。我们还观察到，在一些细胞中，在表达条件稳定的纳米抗体的对照细胞（缺乏GFP或mCherry荧光蛋白）中可以看到APEX的低水平残留染色。因此，必须始终并行进行对照以在缺乏cs-纳米抗体的结合配偶体的细胞中建立APEX-DAB染色水平。
血红素是APEX抗坏血酸过氧化物酶的必需辅助因子，并且某些细胞类型需要在固定之前向培养基中添加牛血红素以增强APEX2活性（Martell 等人，，2012）。然而，一些细胞系含有足够的游离血红素，因此不需要添加到培养基中。到目前为止，我们已经在BHK，HeLa和Caco2细胞上进行了APEX标记，没有添加血红素，现在不添加额外的血红素作为我们标准程序的一部分。
四氧化锇具有剧毒，腐蚀性，需要专业处理。在检查机构政策和当前的MSDS之后，它应该仅用于适当的收容（例如，通风橱）和PPE（例如，手套）。

食谱

牛血红素（如有必要）
在0.01N NaOH中483μM牛血红素
涡旋剧烈溶解
PBS，pH 7.4
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH 2 PO 4
137 mM NaCl
在0.1M二甲胂酸盐缓冲液中的2.5％戊二醛
将25％戊二醛和0.2M二甲胂酸盐缓冲液混合至工作浓度
0.2 M二甲胂缓冲液
将4.28克二甲胂酸钠溶于100毫升水中使用0.2 N HCl（约5.5 ml）将pH调节至7.4
DAB / Cacodylate洗涤混合物和DAB /二甲胂酸盐反应混合物
1. 将DAB片剂溶解至浓度为2mg / ml，剧烈涡旋5分钟
2. 加入0.2M二甲胂酸钠缓冲液至终浓度为0.1M的二甲胂酸钠和1mg / ml的DAB
3. 再涡旋5分钟并使用0.2μm注射器过滤器过滤
4. 将混合物分成两等份;加入过氧化氢至终浓度为5.88mM（DAB /二甲胂酸盐反应混合物）。不含过氧化氢的等分试样是DAB /二甲胂酸盐洗涤混合物
四氧化锇溶液
在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中的1％OsO 4
乙醇系列用于脱水
30％，50％，70％，90％和100％
LX112树脂乙醇系列
乙醇中25％，50％，75％和100％LX112

致谢

这项工作得到了澳大利亚国家健康与医学研究委员会的资助和奖学金（授权号码APP1037320，APP1058565和APP569542到RGP; APP1045092到RGP和NA; APP1099251到TEH和RGP）。
＆NBSP; APEX用于EM是基于Lam 等人（2015）所述的APEX2的开发和应用。不稳定的纳米抗体基于Tang 等人的研究（2016）。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突，也没有竞争利益。

参考

Ariotti，N.，Hall，T.E.，Rae，J.，Ferguson，C.，McMahon，K.A.，Martel，N.，Webb，R.E。，Webb，R。I.，Teasdale，R。D. and Parton，R。G.（2015）。模块化检测GFP标记的蛋白质，通过电子显微镜在细胞和生物体内快速筛查。 Dev Cell 35（4）：513-525。
Ariotti，N.，Rae，J.，Giles，N.，Martel，N.，Sierecki，E.，Gambin，Y.，Hall，T.E。和Parton，R。G.（2018）。使用条件稳定的纳米抗体进行蛋白质相互作用的超微结构定位。 PLoS Biol 16（4）：e2005473。
Hu，C。D.，Chinenov，Y。和Kerppola，T.K。（2002）。使用双分子荧光互补可视化活细胞中bZIP和Rel家族蛋白之间的相互作用。 Mol Cell 9（4）：789-798。
Kubala，M。H.，Kovtun，O.，Alexandrov，K。和Collins，B。M.（2010）。 GFP的结构和热力学分析：GFP-纳米抗体复合物。蛋白质Sci 19（12）：2389-2401。
Lam，S.S.，Martell，J.D.，Kamer，K.J.，Deerinck，T.J.，Ellisman，M.H.，Mootha，V.K。和Ting，A.Y。（2015）。用于电子显微镜和邻近标记的APEX2的定向进化。 Nat方法< / em> 12（1）：51-54。
Martell，J.D.，Deerinck，T.J.，Sancak，Y.，Poulos，T.L.，Mootha，V.K.，Sosinsky，G.E.，Ellisman，M。H. and Ting，A.Y。（2012）。工程抗坏血酸过氧化物酶作为电子显微镜的遗传编码报告。 Nat Biotechnol 30（11）：1143-1148。
Tang，J.C.，Drokhlyansky，E.，Etemad，B.，Rudolph，S.，Guo，B.，Wang，S.，Ellis，E.G.，Li，J.Z。和Cepko，C.L。（2016）。使用条件稳定的纳米抗体检测和操作表达活抗原的细胞。 Elife 5：e15312。