材料和试剂

3,3-二氨基联苯胺（Sigma-Aldrich，目录号：D8001）
0.1 N HCl
95％乙醇（膨化）
冰乙酸（EMD Millipore，目录号：UN2789）
L - （+） - 乳酸（Sigma-Aldrich，目录号：L1750）
甘油（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：15514-011）
铝箔
圆形塑料筛网，其直径接近15ml管（手工制作，帮助小麦叶节浸入染色溶液）。这些塑料屏幕是从一块大块塑料网上切下来的，可以从当地的五金商店或在线商店购买（例如，工业网）。
小麦叶在三叶期（〜2周龄，在温室条件下生长）

设备

聚乙烯50ml圆锥形离心管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：C2745）
聚乙烯15ml锥形离心管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：C2750）
带有盖的玻璃培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3160102）
余额
pH计
振动器
真空
显微镜
干燥剂

程序

制备新鲜DAB染色溶液
1. 测量〜50ml蒸馏水并加入0.1N HCl（1-2滴），直至pH达到3.6
2. 将10ml上述溶液倒入每个15ml管中（所需的管数取决于处理次数）。
3. 称量10mg 3-二氨基联苯胺并加入每个试管中
4. 盖上盖子，用铝箔包裹整个管子，并在轨道振荡器中在37℃下剧烈摇动至少1小时（在此期间可以收集叶子样品）。
5. 检查溶液以查看大部分DAB是否溶解。溶液应无色或浅粉红色，应用于新鲜染色
小麦叶子的染色
1. 在接种病原体或用毒素浸润后的指定时间点收集小麦叶。在这种情况下，在三叶处进行真菌接种和毒素浸润阶段
2. 将叶的渗透或接种区域切成3cm长的区段，并将其浸入具有塑料筛（在一个15ml管中不超过8个叶节段）的DAB溶液中。
3. 将在真空干燥器中移除的所有管和在室温下真空30分钟。在这一步不需要保持管在黑暗中。
4. 释放真空，将所有管子放在黑暗的橱柜中，盖子关闭并孵育过夜
5. 由真菌或毒素引起的坏死区域应该是深棕色的
清除叶子进行检查（所有程序应在通风橱中进行）
1. 使用蒸馏水轻轻冲洗DAB溶液离开染色的叶片段，并稍微用纸巾擦干
2. 将叶片放在用固定液（乙醇/乙酸3：1，V/V）饱和的纸巾上，在培养皿中。允许在培养皿中留有少量额外的溶液。
3. 在室温下在通风橱中孵育叶片段至少24小时（可能需要额外的时间从叶组织中清除所有叶绿素）。
4. 将清除的叶片段转移到用水饱和的纸巾上，并离开30分钟以去除任何固定残留物
5. 在用乳甘油溶液（乳酸/甘油/H 2 O 1：1：1，v/v/v）饱和的纸巾上转移叶片段。允许在培养皿中留有少量额外的溶液。
6. 叶片可以在室温下孵育几小时后进行检查，或者储存在用相同乳糖甘油溶液饱和的纸巾上数周。
7. 为了检查，将叶片段小心地安装在载玻片上并在显微镜下观察以确定DAB的细胞位置。照片可以使用白色背景进行。

致谢

该方案改编自Liu等人（2012）中公开的方法，其最初基于Thordal-Christensen等人（1997）的描述。本协议的制定和实施由USDA-NIFA AFRI微生物生物学计划 - 竞争性补助金＃2010-65108-20543和USDA-ARS CRIS项目＃5442-22000-048-0D资助。

参考文献

Liu，Z.，Z.Zhang，J.D.Faris，R.P.Oliver，R.Syme，M.C.McDonald， B. A. McDonald，P. S. Solomon，S. Lu，W. L. Shelver，S. Xu和T. L. Friesen（2012）。半胱氨酸富集的坏死营养效应物SnTox1由Stagonos pora产生 nodorum触发对携带Snn1的小麦品系的易感性。

8（1）：e1002467。
Thordal-Christensen，H.，Z.Zhang，Y.We和D.B.Colllinge（1997）。 H sub 2 O 2的亚细胞定位。在大麦 - 白粉病相互作用期间，在乳头中的H 2 O 2积累和过敏反应。植物J 1（6）：1187-1194。