材料和试剂

移液器吸头必须无菌且保留率低
Whatman论文：GE Healthcare Whatman定量滤纸40级（Fisher Scientific，GE Healthcare，目录号：09-927-541）
带有PES膜的Thermo Scientific Nalgene快速流动无菌一次性过滤装置（Thermo Fisher，目录号：569-0020）
15毫升和50毫升管（康宁，目录号：430790和430828）
1.5毫升和2.0毫升Eppendorf管蛋白低结合（Eppendorf，目录号：022431081和022431102）
FACS管：5 ml聚苯乙烯圆底管，40μm细胞过滤器顶部（Corning，Falcon®，目录号：352235）
70μm细胞过滤器（Fisher Scientific，目录号：22-363-548）
40μm细胞过滤器盖
剃刀片
盘子
干冰
2-巯基乙醇（BME）（西格玛奥德里奇，目录号：M6250-100）
RNasin Ribonuclease Inhibitors（Promega，目录号：N2115）
RNA Later（Life Technologies，目录号：AM7020）
Miltenyi神经解离试剂盒（NDK）（木瓜蛋白酶）（MACS Miltenyi Biotec，Miltenyi，目录号：130-092-628）
注意：储存在2-8°C，保质期：自生产之日起24个月。
Fc块：纯化的大鼠抗小鼠CD16 / CD32（Fisher Scientific，BD Pharmingen，目录号：BDB553142）（在4°C储存）
CD31-APC：APC大鼠抗小鼠CD31（BD Biosciences，目录号：551262）（在2-8°C保存）
CD45-APC / Cy7：APC / Cy7大鼠抗小鼠CD45（BioLegend，目录号：103115）（2-8°C储存）
或CD45-FITC：FITC大鼠抗小鼠CD45（BD Pharmingen，目录号：553080，克隆30-F11）
CD11b-BV421：Brilliant Violet 421大鼠抗小鼠CD11b（BioLegend，目录号：101235）（2-8°C储存）
碘化丙啶（PI）：碘化丙啶溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4864）（2-8°C保存）
RNeasy Plus Micro试剂盒（QIAGEN，目录号：74034）
可选：大鼠单克隆抗VCAM1（克隆M / K-2.7，Bioxell，目录号：BE0027）
可选：大鼠IgG1同种型抗体（克隆HRPN，Bioxell，目录号：BE0088）
可选： DyLight TM抗体标记试剂盒（DyLight TM 488，Thermo Scientific，目录号：53025）
改良DPBS（mDPBS）（见食谱）
注意：无菌过滤器溶液，储存在2-8°C，保质期：自生产之日起36个月。
1. Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）与钙和镁（Thermo Fisher，Gibco TM，目录号：14040-133）
  注意：储存在2-8°C，保质期：自生产之日起36个月。
2. 葡萄糖（1,000 mg / L）（Fisher Scientific，ACROS Organics，目录号：41095-5000）
3. 丙酮酸钠（30 mg / L）（Thermo Fisher，Gibco TM，目录号：11360-070）
FACS缓冲液（见食谱）
注意：无菌过滤器溶液，储存在2-8°C，保质期：自生产之日起3个月。
1. 修改后的DPBS
2. 0.5％BSA（Fisher Scientific，目录号：BP1600-100）
3. 2 mM EDTA（Thermo Fisher，Invitrogen TM，目录号：AM9912）
0.9 M蔗糖（见食谱）
蔗糖在DPBS（Fisher Scientific，目录号：BP220-10）
注意：无菌过滤器溶液，储存在2-8°C，保质期：自生产之日起3个月。

设备

刻度量筒
-80°C冰箱
振动筛
离心机（Eppendorf，型号：5810R，目录号：022625004）
温水浴（预热37°C）＆nbsp;
多功能旋转器（Thermo Fisher，Lab Rotator，目录号：2309-1CEQ）
BD FACSAria TM II或III细胞分选仪（BD Biosciences）
微型剪刀，精细钳子＆nbsp;
Agilent 2100生物分析仪（安捷伦科技）

软件

BD FACSDIVA TM软件（BD Biosciences，版本：V8.0.1）
FlowJo TM（©FlowJo，LLC，版本：9.9.4或更高版本）

程序

注意：

除非另有说明，否则在室温下进行所有离心和染色步骤。流式细胞分选仪应设置为100μm喷嘴。
提前准备所有试剂并在必要时温热至室温。
可选：标记粘附分子，如VCAM1，其独特地富集动脉和静脉BEC（Vanlandewijck 等，2018; Yousef et al。，2018），关于BEC血管节段富集。如果需要VCAM1（或其他粘附分子）标记，缀合抗VCAM1 mAb和大鼠IgG1同种型对照抗体DyLight TM -488根据制造商的说明。＆nbsp;
小鼠：小鼠用阿佛丁麻醉后，在采血后用20毫升冷PBS灌注。
可选：使用LPS刺激的小鼠设置对照：小鼠在灌注前用LPS处理16小时和2小时（1mg / kg，腹膜内）。在细胞分离和流式细胞术分析之前2小时，给小鼠注射荧光标记的抗VCAM1 mAb（100μg，r.o。）或IgG1同种型对照。
如果需要进行血管节段富集，所有实验性（健康）小鼠在细胞分离前2小时也注射抗VCAM1 mAb（100μg，r.o。）。

组织解离
1. 对于每个样品，通常包括来自1-2个脑的解剖的皮层/海马体，用于诸如大量RNA-Seq或汇集的海马（来自4只小鼠）的应用，用于诸如单细胞RNA-Seq的应用（Yousef 等。，2018），在神经离解试剂盒（NDK）中预热1.5 ml缓冲液X +在15°F的水浴中，在15 ml Falcon试管中从NDK中加入9μl2-巯基乙醇（BME）+50μl酶P 。
2. 在Whatman纸上滚动全脑去除脑膜。
3. 使用微型剪刀和镊子在无菌板中解剖海马，皮质和大脑的其余部分。使用剃刀刀片分离单个组织并大致切成细小的碎片。将大脑节段切割到这样的程度，即你可以将切碎的组织穿过修剪过的1毫升移液器（修剪后意味着切割尖端以增加孔的直径以使切碎的组织能够通过），但不是这样切碎，它变得非常糊状，可以通过一个未修剪的1毫升移液器。如果大脑过于剁碎，可能会在后续步骤中过度消化酶混合物，导致细胞丢失。＆nbsp;
4. 或者，如果分开分离海马或其他非常小的脑区域，则不必在无菌平板中切碎。相反，使用无菌镊子将每个切开的小组织转移到1.5ml含有0.5ml来自NDK的缓冲液X的Eppendorf管中，并用微型剪刀精细切碎。
5. 使用修剪的1毫升尖端（修剪意味着切割尖端以略微增加孔的直径），将精细切碎的样品转移到步骤A1中制备的预热缓冲液X溶液中。用相同的移液管尖端研磨10次。在37°C水浴中孵育15分钟。每5分钟孵育一次。从NDK为每个样品制备酶2混合物：10μl酶A +20μl缓冲液Y.
6. 在每个样品中加入30μl酶2混合液，用1 ml移液管尖端研磨10次，从第一个样品接受酶2混合物开始10分钟计时。将样品在37°C水浴中孵育10分钟计时器的剩余时间，每5分钟轻弹一次样品。
  注意：快点！不要过度孵化，过度消化会导致产量低下。
7. 准备50毫升管与70微米细胞过滤器，洗涤过滤器与1毫升mDPBS。将流通物收集在50毫升管中。＆nbsp;
8. 用1ml移液管尖端研磨样品10次，并立即加入10ml mDPBS。
9. 将所有上清液通过步骤A7中制备的70μm细胞过滤器。用另外5ml mDPBS洗涤。
10. 在300 x g 下离心10分钟。丢弃上清液并收集沉淀。小心吸取上清液，不要打扰沉淀。
髓鞘去除和染色
1. 将颗粒重悬于5ml（海马样品2.5ml）0.9M蔗糖中，并将每个沉淀转移至15ml管中。在850 x g 下离心15分钟。丢弃上清液，收集沉淀物。小心吸取并丢弃上清液，不要打扰沉淀。
2. 样品重新悬浮
  1. 对于海马样本：
    将沉淀重悬于2ml FACS缓冲液中，转移至2ml Eppendorf管中并等待其他组织类型样品，然后继续进行步骤B3。
  2. 对于Cortex和Whole Brain样本：
    将沉淀重悬于1ml 0.9M蔗糖中，然后再加入另外2ml蔗糖。在850 x g 下离心15分钟。丢弃上清液，不要打扰沉淀。将沉淀重悬于2ml FACS缓冲液中，转移至2ml Eppendorf管中。
3. 将所有样品在300 x g 下离心5分钟。准备Fc阻断溶液（每个样品100μl）：
  对于10个样品，在1ml FACS缓冲液中稀释10μlFcBlock。计划需要哪些补偿标准（每个标记的单通道补偿，以及2个未染色的对照，有和没有碘化丙啶（PI），在下面的步骤C3中添加）。对于皮质合并的样品，细胞沉淀是可见的，但对于海马样品可能不可见。请注意下面步骤C6中的估计单元格数。＆nbsp;
4. 将每个样品重悬于上述步骤B3中制备的100μlFc阻断溶液中（对于用于补偿标准品的样品，对于每个计划的补偿标准，向样品中添加额外的25μlFc阻断溶液）。在室温下在振荡器上孵育5-10分钟。
5. 加入以下抗体（1：100）并在摇床上孵育30分钟：
  抗CD31-APC
  抗CD11b-BV421
  抗CD45-APC / Cy7或抗CD45-FITC
  注意：如果小鼠如上所述注射荧光标记的抗小鼠VCAM1-DyLight TM 488，则在APC中染色CD45 / Cy7通道，以及APC和FITC通道中的门CD31 + VCAM1 +细胞。＆nbsp;
6. 加入1.8ml FACS缓冲液稀释样品，然后以300 x g 离心5分钟。
7. 准备分选混合物：FACS缓冲液+ PI（1：5,000的1 mg / ml原液）+ RNase抑制剂（1：500）（对于5 ml：加入1μlPI和10μlRNase抑制剂）。＆nbsp;
8. 小心吸取上清液，将每个样品（补偿标准除外，重悬于0.5 ml FACS缓冲液中）重悬于0.5 ml分选混合液中。
9. 通过细胞过滤器加盖的FACS管（蓝色40μm细胞过滤器盖）转移所有样品。保持在冰上并避光，直至通过流式细胞仪分选。＆nbsp;
10. 如果收集整个群体细胞：随后准备1.5毫升无RNA酶的收集管和0.5毫升RNA。准备好在收集细胞后用RNA稀释样品至总体积为1.3 ml，并用干冰快速冷冻样品。＆nbsp;
11. 如果收集单个细胞：按照制造商的指示用所选技术制备用RNA裂解缓冲液制备的平板，并保持冷冻并储存在-80℃直至用于细胞分选（aka，如前所述的Smart-seq-2方案[Picelli] et al。，2014; Darmanis et al。，2015]，用于Yousef et al。 [2018]研究）。＆nbsp;
注意：＆nbsp;
1. 此协议未涵盖FACS参数设置的详细说明。如需帮助，请联系您的FACS核心设施经理或FACS机器供应商。
2. 使用100μm喷嘴。
3. 在排序时，将阈值速率保持在设定频率值的100倍左右（通常每秒少于2,800个事件）。
4. 每个染色样品的估计分拣时间为15-20分钟。
FACS和样品采集
1. 运行未染色的细胞以设置前向（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）（图2B）。
2. 运行单色控件以设置FACS参数并补偿通道溢出。
3. 在运行单个样品之前，从1 mg / ml（0.2μg/ ml终浓度）（或1：500 1:10预稀释）PI中加入1：5,000 PI进行活/死染色，如果是尚未在上面的髓磷脂去除和染色部分的步骤B7中添加。＆nbsp;
4. 对于您的第一次运行以及每当获得新抗体时：运行对照，其中细胞用除1之外的所有抗体染色，以确定阳性细胞群并相应地设置门。＆nbsp;
5. 运行染色的FACS样品：
  1. 门前细胞（FSC-A =大小）和侧向散射（SSC-A =内部结构）以排除细胞碎片和残留髓鞘
  2. 绘制针对FSC-W的FSC-A以区分单细胞和细胞双联体/聚集体。
  3. 排除PI阳性（死亡）细胞。
  4. 通过门控CD45和CD11b阴性细胞排除CD11b + CD45 +单核细胞/巨噬细胞和小神经胶质细胞。
  5. 在CD31 + BEC上接门并从该门收集细胞以获得纯脑内皮细胞群。记录至少1 x 10 6事件。
6. 收集细胞：＆nbsp;
  1. 1.5毫升不含RNase的试管含有FACS缓冲液（如果RNA完整性不太重要）或0.5毫升RNA后（保留以后用于大量RNA-Seq的RNA分离）。如果以后含有0.5毫升RNA：＆nbsp;
    1. 理想情况下，最佳RNA提取需要100,000个细胞或更多细胞。然后将RNA加完至1.3毫升，然后充分混合并用干冰快速冷冻样品。储存在-80°C直至RNA分离。＆nbsp;
    2. 当旋转细胞以提取RNA时，解冻细胞并温热至室温，然后在1,000 x g 离心10分钟。使用RNeasy Plus Micro试剂盒（QIAGEN）从细胞沉淀中分离总RNA。使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies）评估RNA量和RNA质量。所有样品均通过质量控制阈值（RIN≥8.5）以进行文库制备和RNA-Seq。
  2. 96孔板中的单细胞，RNA裂解缓冲液用于单细胞RNA-Seq（根据Smart-Seq-2 [Picelli et al。，2014; Darmanis et al。，2015]或其他首选协议）。
    注意：
    1. 将板冷冻在干冰上，直到它们用于分选细胞。在细胞分选后立即用铝冷冻相容的盖子盖住每个平板，涡旋平板以将细胞与RNA裂解缓冲液混合，并在干冰上冷冻平板直至其可以转移并储存在-80℃直至RNA分离。＆nbsp;
    2. 对于典型的1-2皮层/海马体样本来分离大量细胞用于RNA提取（也称为大量RNA-Seq），通过流式细胞术分选将导致大约100,000个分离的CD31 + 每个样本的BEC。对于4个汇集的海马的典型样本，通过流式细胞术分选导致收集数千至数万个细胞，这些细胞通过制备，细胞收集方法（大量或单个细胞）和VCAM1富集而变化。＆nbsp;

数据分析

请参阅BioRxiv上发布的Yousef et al。（2018）进行数据分析
这个BEC隔离协议在Yousef 等人（2018）论文的以下图中使用：
图1a-c：年轻和年老皮质/海马BEC的大量RNA-Seq。
补充图1a-e：年轻和年老皮质/海马BEC的大量RNA-Seq。
补充图1f-k： C57BL6小鼠在灌注前2小时注射抗VCAM1-DL488或IgG-DL488同种型对照（ro），以在脑解离，染色和FACS之前在体内标记BEC。。然后将海马细胞用于单细胞RNA-Seq（图2和补充图2）。
图2和补充图2：从海马分离的BEC的单细胞RNA-Seq。
图3c-d：从用年轻或年老血浆处理的幼小鼠中分离BEC，并在灌注前2小时注射抗VCAM1-DL488或IgG-DL488同种型对照（ro）以标记BEC 在脑解离，染色和FACS之前的体内。用LPS刺激的幼鼠被用来设置门。＆nbsp;
请参阅Czupalla et al。（2018） Bio-Protocol 中的“使用流式细胞仪对原代小鼠脑内皮细胞进行基于胶原酶的单细胞分离”的替代方案用于通过流式细胞术分离BEC细胞，其使用更温和的基于胶原酶的方法和几种标记物来染色其他细胞类型。该方案用于在BioRxiv上发表的Yousef 等人（2018）论文中的补充图7a-d，以显示在他莫昔芬处理的Vcam1 fl / fl <中的Vcam1的遗传重组和缺失。 / sup> Slco1c1-Cre ERT2 +/-小鼠。

食谱

改性DPBS（mDPBS）（500 ml）＆nbsp;
1. 在量筒中测量500mg葡萄糖
2. 向量筒中加入1.36ml 100mM丙酮酸钠，然后加入DPBS至500ml切口
3. 使用封口膜密封量筒，并通过倒置几次彻底混合
4. 混合后，使用Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow无菌过滤装置（0.2μm孔）进行无菌过滤
FACS缓冲液（500毫升）
1. 将2.5g BSA和2ml 0.5M EDTA加入500ml mDPBS中
2. 使用具有0.2μm孔的Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow无菌过滤器单元彻底混合并使用无菌过滤器
0.9 M蔗糖（500 ml）
1. 在量筒中测量154.04g蔗糖
2. 将DPBS添加至500毫升切口
3. 使用封口膜密封量筒，并通过倒置几次彻底混合
可选：如果混合物未完全溶解，请在加热的水浴中轻轻加热溶液并混合。混合后，使用Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow无菌过滤装置（0.2μm孔）进行无菌过滤。

致谢

我们感谢Lusijah Sutherland博士和Corey Cain博士，负责管理Palo Alto VA的核心流式细胞仪设施并提供H.Y.和C.J.C.关于文书的培训; Corey Cain博士还提供他的实验建议，流式细胞仪检测和PBMC分析以及深思熟虑的讨论。我们还要感谢Ryan Watts博士和Nga Bien-Ly博士分享用于RNA-Seq的原始BEC分离方案。这项工作由退伍军人事务部（TW-C。），国家老龄化研究所（SPO：116650; 1F32AG051330-01A1至HY，R01-AG045034和DP1-AG053015至TW-C）资助，NOMIS基金会（TW-C。），格伦老龄化研究基金会（TW-C），向HY提供SPARK资助通过斯坦福临床和转化科学奖（CTSA）到Spectrum（UL1 TR001085），美国国立卫生研究院（R01-GM37734和R37-AI047822到ECB，RO1 AI109452到HH），斯坦福免疫，移植和感染研究所（ CJC）和Edinger Institute（CJC）。 CTSA计划由美国国立卫生研究院（NIH）的国家推进转化科学中心（NCATS）领导。

利益争夺

没有竞争利益冲突。

伦理

根据美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南，在该方案中使用的小鼠在内部繁殖并老化并在无病原体条件下在12小时光 - 暗循环下生活。

参考

Abbott，N.J.，Patabendige，A.A.，Dolman，D.E.，Yusof，S.R。和Begley，D.J。（2010）。血脑屏障的结构和功能。 Neurobiol Dis 37（1）：13-25。
Banks，W。A.（2016）。从血脑屏障到血脑界面：中枢神经系统药物输送的新机会。 Nat Rev Drug Discov 15（4）：275-292。
Czupalla，C.J.，Yousef，H.，Wyss-Coray，T。和Butcher，E.C。（2018）。使用流式细胞仪基于胶原酶的原代小鼠脑内皮细胞单细胞分离。 Bio-协议 8（22）：e3092。
Daneman，R.，Zhou，L.，Agalliu，D.，Cahoy，J.D.，Kaushal，A。和Barres，B.A。（2010）。小鼠血脑屏障转录组：了解脑内皮细胞发育和功能的新资源。 PLoS One 5（10）：e13741。
Darmanis，S.，Sloan，S.A.，Zhang，Y.，Enge，M.，Caneda，C.，Shuer，L。M.，Hayden Gephart，M。G.，Barres，B。A.和Quake，S。R.（2015）。单细胞水平的人脑转录组多样性调查。 Proc Natl Acad Sci USA 112（23）：7285-7290。
Engelhardt，B.，Vajkoczy，P。和Weller，R。O.（2017）。中枢神经系统免疫特权的推动者和塑造者。 Nat Immunol < / em> 18（2）：123-131。
Picelli，S.，Faridani，O.R.，Bjorklund，A.K.，Winberg，G.，Sagasser，S。和Sandberg，R。（2014）。使用Smart-seq2从单个细胞中获得全长RNA-seq。 Nat Protoc 9（1）：171-181。
Tam，S.J.，Richmond，D.L.，Kaminker，J.S.，Modrusan，Z.，Martin-McNulty，B.，Cao，T.C.，Weimer，R.M.，Carano，R.A.，van Bruggen，N。和Watts，R.J。（2012）。死亡受体DR6和TROY调节脑血管发育。 Dev Cell 22（2）：403-417。
Vanlandewijck，M.，He，L.，Mae，MA，Andrae，J.，Ando，K.，Del Gaudio，F.，Nahar，K.，Lebouvier，T.，Lavina，B.，Gouveia，L。， Sun，Y.，Raschperger，E.，Rasanen，M.，Zarb，Y.，Mochizuki，N.，Keller，A.，Lendahl，U。和Betsholtz，C。（2018）。脑血管系统中细胞类型和分区的分子图谱。自然 554（7693）：475-480。
Yousef，H.，Czupalla，CJ，Lee，D.，Burke，A.，Chen，M.，Zandstra，J.，Berber，E.，Lehallier，B.，Mathur，V.，Nair，RV，Bonanno， L.，Merkel，T.，Schwaninger，M.，Quake，S.，Butcher，EC和Wyss-Coray，T。（2018）。老年血液抑制海马神经发生，并通过血脑屏障的VCAM1激活小胶质细胞。 bioRxiv 。 doi：10.1101 / 242198。