材料和试剂

微量离心管（FCR＆amp; Bio，目录号：MPF-150C）
一次性移液器（VWR，目录号：89130-396-898 / 900）
提示（BMBio，目录号：BIO1000RF，BMT-200LYRS）
15毫升和50毫升锥形管（VIOLAMO，目录号：1-3500-21,1-3500-22）
细胞刮刀（NIPPON Genetics，目录号：TR9000）
35毫米细胞培养皿（Thermo Scientific，目录号：130180）
Whatman纤维素层析纸3MM Chr板材（Whatman，目录号：3030-917）＆nbsp;
Amersham Protran Premium 0.45 NC硝酸纤维素蛋白质印迹膜（GE Healthcare，目录号：10600034）
蛋白G-sepharose珠（GE Healthcare，目录号：17061801）
纸巾（Elleair，目录号：703153）
过滤纸
HEK293细胞（ATCC，目录号：CRL-1573）＆nbsp;
抗HA抗体（Santa Cruz，目录号：sc-7392）
抗Myc抗体（圣克鲁斯，目录号：sc-40）
抗Flag抗体（西格玛，目录号：F1804）
Anti-GlcNAc抗体（Santa Cruz，目录编号：RL2，sc-59624）
抗肌动蛋白抗体（Wako，目录号：013-24553）
抗OGT抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录号：ab96718）
Anti-Nup62抗体（Santa Cruz，目录号：sc-25523）
抗AGFG1（Arf-GAP结构域和含FG重复的蛋白1）抗体（Abcam，目录号：ab86349）
HRP偶联的二抗
抗小鼠（GE Healthcare，目录号：NA931-1 ml）
抗兔（GE Healthcare，目录号：NA934-1 ml）
脱氧胆酸钠（DOC）（西格玛，目录号：D6750）
O-（2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖基氨基）N-苯基氨基甲酸酯（PUGNAc）（Sigma，目录号：A7229）
Thiamet-G（TMG）（Cayman，目录号：13237）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（NACALAI TESQUE，目录号：27327-94）
来自牛肺的抑肽酶（NACALAI TESQUE，目录号：03346-84）
Leupeptin Hemisulfate（NACALAI TESQUE，目录号：20454-76）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（10x）（pH 7.4）（NACALAI TESQUE，目录号：27575-31）
过氧二硫酸铵（APS）（Wako，目录号：012-20503）
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（NACALAI TESQUE，目录号：205-06313）
2-丁醇（叔丁醇）（NACALAI TESQUE，目录号：06101-55）
脱脂奶粉（Wako，目录号：190-12865）
Bio-Rad蛋白质分析染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006ja）
含有L-Gln和丙酮酸钠的DMEM（1.0 g / L葡萄糖），液体（NACALAI TESQUE，目录号：08456-65）
200 mM L-谷氨酰胺储备液（NACALAI TESQUE，目录号：16948-04）
青霉素 - 链霉素混合溶液（100倍浓缩原液）（NACALAI TESQUE，目录号：09367-34）
WGA蛋白（J-OIL MILLs，目录号：J120）
增强化学发光（ECL）Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare，目录号：RPN2109）
ECL prime Western Blotting Detection Reagent（GE Healthcare，目录号：RPN2232）
白蛋白，牛血清，无球蛋白（牛血清白蛋白）（BSA）（NACALAI TESQUE，目录号：01281-84）
用于SDS-PAGE的预染色蛋白标记（宽范围）（NACALAI TESQUE，目录号：02525-35）
HRP-共轭琥珀酰基WGA（sWGA）（EY-实验室，目录号：H-2102-1）
2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇999（Tris）（Wako，目录号：011-16381）
盐酸（HCl）（35％）（NACALAI TESQUE，目录号：18321-05）
乙二胺-N，N，N'，N'-四乙酸，二钠盐，脱水（EDTA）（Dojindo，目录号：N001）
氯化钠（NaCl）（NACALAI TESQUE，目录号：31320-05）
Triton X-100（NACALAI TESQUE，目录号：35501-15）
甘油（NACALAI TESQUE，目录号：17018-83）
2-巯基乙醇（NACALAI TESQUE，目录号：21438-82）
十二烷基硫酸钠（SDS）（NACALAI TESQUE，目录号：31606-75）
溴酚蓝（BPB）（NACALAI TESQUE，目录号：05808-61）
甘氨酸（NACALAI TESQUE，目录号：17109-64）
甲醇（NACALAI TESQUE，目录号：21915-93）
聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯（吐温-20）（NACALAI TESQUE，目录号：35624-15）
30％（w / v） - 丙烯酰胺/双混合溶液（37.5：1）（NACALAI TESQUE，目录号：06144-05）
X-tremeGENE 9 DNA转染试剂（Sigma，目录号：06365809001）
FCS
原种细胞裂解缓冲液（见食谱）
5x SDS-PAGE上样缓冲液（见食谱）
库存分离凝胶缓冲液（见食谱）
库存堆积凝胶缓冲液（见食谱）
转移缓冲区（见食谱）
10x用于电泳的运行缓冲液（参见食谱）
TBST（见食谱）＆nbsp;
一抗溶液（见食谱）
二抗溶液（见食谱）

设备

P1000，P200和P20移液器（Gilson，产品目录号：F123602，F123601，F123600）
电泳用玻璃板（Nihon-Eido，目录号：NA-1000-3，NA-1000-4）
夹子（Nihon-Eido，目录号：NA-1000-15）
凝胶梳（Biocraft，目录号：NO-MC141）
细胞培养箱（Panasonic，型号：MCO-19AIC）
冷柜（松下，型号：MDF-U700VX）
涡旋混合器（M＆amp; S Instruments，型号：VORTEX-GENIE 2混合器）
台式振动台（TAITEC，型号：Wave-SI）
PowerPac通用电源（Bio-Rad Laboratories，目录号：1645070JA）
用于聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质电转移的转移装置（Biocraft，目录号：BE350）
迷你型电泳仪（凝胶厚度，1 mm; Nihon-Eido）
微型冷冻离心机（KUBOTA，型号：3740）
用于成像和分析Western印迹的数字系统（FUJIFILM，型号：LAS-1000 Plus和Image Gauge）
旋转器（EYELA，型号：MBS-1）

程序

用于电泳的细胞裂解物的制备
1. 在含有10％FCS，2mM L-谷氨酰胺的2ml DMEM中，在35mm培养皿（2-5×10 5 细胞）上培养HEK293（ATCC，目录号：CRL-1573）细胞。 100倍稀释的青霉素 - 链霉素。
2. 在70％-90％汇合时，从每个孔中吸出培养基并用
  洗涤细胞 2毫升冰冷的PBS。
3. 吸出PBS后，每孔加入200μl裂解缓冲液，用冰上细胞刮刀收集细胞。
  注意：在收获细胞之前，将以下化学物质添加到储备裂解缓冲液中以产生指定的最终浓度：0.5％DOC; 50μMPUGNAc; 10μMTMG; 1 mM PMSF; 10μg/ ml抑肽酶;和10μg/ ml亮肽素。>
4. 收获后，剧烈涡旋细胞，在4℃下以15,000 x g >离心15分钟，然后将上清液转移到新管中。
  注意：细胞裂解液应储存在-80°C。等分试样应该进行多次检测。>
5. 使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒通过Bradford方法测量每个样品的蛋白质浓度。
6. 将5x SDS-PAGE上样缓冲液与每个样品（约10-20μg）混合至最终的1x浓度。
7. 在100℃下煮沸4分钟并在室温下短暂离心（R.T.）。
Myc标记蛋白的免疫纯化
1. 根据制造商的程序，使用X-tremeGENE 9 DNA转染试剂将编码Myc标记的蛋白质的pcDNA3质粒转染到细胞中。转染后24小时，更换培养基。
2. 在37℃下再孵育24小时后，用冰冷的PBS洗涤细胞，并在冰上用200μl裂解缓冲液收获细胞。
3. 将细胞裂解物在15,000 x g >下在4℃下离心15分钟，然后将上清液转移到新管中。
4. 将30μl蛋白G-琼脂糖珠（用裂解缓冲液预先洗涤，50％浆液）加入到全细胞裂解物中并在4℃下旋转1小时。
5. 在4°C下以3,500 x g >离心1分钟，然后将上清液转移到新管中。
  注意：预清除步骤B4-B5有助于通过消耗非特异性结合珠子的蛋白质来降低免疫印迹中的背景信号。>
6. 向预先澄清的上清液中加入1μg抗Myc抗体，在4℃温和旋转孵育3小时。
7. 加入40μl蛋白G-sepharose珠（用裂解缓冲液预先洗涤，50％浆液），然后在4℃下旋转1小时。
8. 在4℃下以3,500 x g >离心1分钟。
9. 吸出上清液，用1 ml含0.1％SDS和0.5％DOC的裂解缓冲液洗涤沉淀的珠子。
  注意：我们通常通过翻转管来清洗珠子。>
10. 重复洗涤步骤B8-B9共三次。
11. 向每个样品中加入适当体积（大约等于沉淀珠粒的）水稀释的2x SDS-PAGE上样缓冲液。
12. 涡旋后，将样品在95℃下煮沸4分钟，并在15℃下以15,000 x g >离心1分钟。
制备WGA-聚丙烯酰胺凝胶层
1. 用夹子夹住两块玻璃板并放在水平位置。
  注意：为了确认WGA诱导O-GlcNAc蛋白的分离，我们建议同时制备标准丙烯酰胺凝胶。>
2. 为制备7.5％丙烯酰胺分离凝胶溶液，通过温和倒置混合5 ml 30％丙烯酰胺溶液，5 ml分离凝胶缓冲液（参见配方），10 ml去离子水，90μl10％APS和30μlTEMED 。
  注意：我们通常使用迷你尺寸的玻璃板[100 mm（宽）x 100 mm（长）x 1 mm]。>
3. 将分离的凝胶溶液（5ml /板）倒在两块玻璃板之间。所得分离凝胶的高度约为5厘米。将水饱和的2-丁醇分层到分离凝胶的表面上以形成水平凝胶表面，并在R.T.处将凝胶孵育约20分钟。注意：丙烯酰胺凝胶的浓度应根据目标蛋白质的分子量进行选择。以下网站可用于确定合适的凝胶浓度：> http://www.bio-rad.com/en-jp/category/protein-gel-migration-charts?ID=N3F3TIDN 。
4. 在凝胶聚合（约30分钟）后，丢弃分离凝胶表面上的2-丁醇，并用去离子水洗涤凝胶顶部数次。
5. 为制备WGA-聚丙烯酰胺凝胶溶液，混合0.375毫升10毫克/毫升WGA溶液（见注），0.25毫升30％丙烯酰胺溶液，0.25毫升分离凝胶缓冲液，0.119毫升去离子水，4.5微升通过温和倒置，10％APS和1.5μlTEMED。
  注意：将WGA蛋白（5 mg）新鲜溶解于0.5 ml 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中，使最终浓度为10 mg / ml。 WGA溶液的冷冻和融化降低了WGA-凝胶层中O-GlcNAc化蛋白质的分离效率。注意凝胶中SDS的浓度：在我们使用的条件下，SDS对WGA与GlcNAc的结合亲和力没有太大影响。>
6. 将WGA-聚丙烯酰胺凝胶溶液倒入分离凝胶层（1ml /板）的顶部。如步骤C3，将水饱和的2-丁醇层压到溶液表面上。
  注意：在该研究中测试的分离O-GlcNAcylated蛋白的最佳实验条件是9mm凝胶长度和3.75mg / ml WGA。请注意，这些值可能因其他O-GlcNAcylated蛋白的分离而异。>
7. 凝胶聚合后，弃去WGA-聚丙烯酰胺凝胶表面上的2-丁醇，并用去离子水洗涤凝胶顶部数次。
8. 为制备堆积凝胶溶液，混合1.5ml 30％丙烯酰胺溶液，2.5ml堆积凝胶缓冲液，6ml去离子水，90μl10％APS和30μlTEMED。
9. 将堆积凝胶溶液倒在WGA-凝胶层（2ml /板）的顶部，并立即将凝胶梳插入堆积凝胶溶液中。得到的堆积凝胶约为1厘米。
  注意：为了确认O-GlcNAc蛋白的WGA依赖性分离，还应使用WGA-SDS-PAGE实验中使用的相同样品进行标准SDS-PAGE。 WGA和非WGA凝胶可以并行运行。>
运行WGA-SDS-PAGE
1. 将煮沸的样品（冷却至R.T.）装入堆积凝胶的孔中。
  注意：在电泳过程中，WGA层还会诱导商业上可获得的分子量标记中包含的几种蛋白质的迁移率的延迟，这可能是因为它们的GlcNAc修饰。因为细菌细胞不表达OGT，细菌表达的重组蛋白不会被O-GlcNAc修饰。因此，一些细菌表达的重组蛋白，如GST和GFP，可以在WGA-SDS-PAGE中用作分子量标记。>
2. 在4 mA的恒定电流10 mA /凝胶下进行电泳，直到BPB染料到达分离凝胶的底部。
  注意：运行时间取决于WGA和分离凝胶中聚丙烯酰胺的浓度。>
3. 电泳完成后，用转移缓冲液在R.T.
  洗涤分离凝胶15分钟注意：传输缓冲区的配方如下所述（参见配方）。>
4. 将两层转移缓冲液浸泡的滤纸放在凝胶下面，然后在硝酸纤维素膜上放置另外两层转移缓冲液浸泡的滤纸在凝胶上面。
  注意：根据目标蛋白质的分子量，选择合适的孔径（0.2或0.45μm）的硝酸纤维素膜。>
5. 在转移装置中的转移缓冲液中，在4°C下进行转移。
  注意：最好使用湿/槽印迹系统以避免加热（在0.42 mA的恒定电流条件下，4°C下4小时）。>
免疫印迹分析
1. 将硝酸纤维素膜与TBST中的4％脱脂乳（参见配方）在R.T.孵育1小时。
2. 每次用TBST冲洗膜三次，每次5分钟。
3. 将膜在一抗溶液中孵育（在R.T.放置1小时或在4℃放置过夜，轻轻摇动）。
  注意：为了使用抗O-GlcNAc抗体（> 例如> ，RL2）检测蛋白质O-GlcNAc化，一抗溶液必须由3％BSA / TBST以避免增加背景信号。>
4. 每次用TBST冲洗膜三次，每次5分钟。
5. 将膜在第二抗体溶液中孵育（在R.T.处1小时）。
6. 每次用TBST冲洗膜三次，每次5分钟。
7. 使用ECL可视化膜上的抗体结合蛋白。
  注意：根据制造商的手册使用适当数量的ECL解决方案。在ECL反应之前，应使用纸巾除去膜上的额外TBST。与ECL溶液孵育后，也要除去多余的液体。>

数据分析

Nup62，一种代表性的O-GlcNAc蛋白，在WGA-SDS-PAGE中作为分离凝胶顶部附近的单个高分子量条带被观察到（图2B，上图，泳道1）。为了证实这种高分子量条带表明O-GlcNAc化形式的Nup62，我们使用其中内源OGT蛋白被RNA干扰（RNAi）耗尽的细胞。在细胞中转染对OGT特异的合成双链小干扰RNA（siRNA）导致不同细胞蛋白的O-GlcNAc化降低（图2A，下图，泳道1和2）。在这种条件下，Nup62的高分子量带几乎完全消失，其消失伴随着较低分子量Nup62带的出现（图2B，上图，泳道2）。因此，与非O-GlcNAc修饰的蛋白质的迁移相比，基于WGA的电泳导致O-GlcNAc修饰的Nup62迁移中的“升档”。与Nup62不同，AGFG1（也是已知的O-GlcNAc蛋白）的免疫印迹显示，当OGT被siRNA耗尽时，不会出现单个但多个高分子量的条带，这导致AGFG1作为单个较低分子迁移重量带（图2A和2B，底部面板，泳道2）。重要的是，当通过不含WGA-凝胶层的标准SDS-PAGE分离这些蛋白质时，未观察到在WGA-凝胶上观察到的较高分子量条带（图2C），进一步表明较慢迁移的条带在WGA凝胶是这些蛋白质的O-GlcNAc修饰形式。
＆NBSP;可以通过量化WGA介导的上移带的强度来评估特定蛋白质的O-GlcNAcylation水平。虽然细胞中几乎所有Nup62蛋白均以均质和高度O-GlcNAc修饰的形式存在，但AGFG1以异质O-GlcNAc化形式存在，并且仅有26％的AGFG1以非O-GlcNAc化形式存在（图2B，下图，泳道） 1），表明大多数AGFG蛋白在细胞中的多个位点是O-GlcNAc化的。通过RNAi消耗OGT消除了这些AGFG1的上移条带（图2B，下图，泳道2），同时用强效OGA抑制剂Thiamet-G（TMG）处理细胞，这增加了O-GlcNAcylation水平的多样性细胞蛋白（图2A，下图，泳道3）增强了WGA-SDS-PAGE中上移AGFG1条带的强度（图2B，下图，泳道3）。当表位标记的O-GlcNAc蛋白如TFG和UBAP2L在细胞中用OGT瞬时表达时，观察到上移的条带（图3A和3B）。合并的数据表明WGA-SDS-PAGE方法原则上可以通过使用其特异性抗体的蛋白质印迹检测任何内源或表位标记的蛋白质的O-GlcNAc化，从而可以容易地评估蛋白质的O-GlcNAcylation状态。感兴趣的。

图2.通过WGA-SDS-PAGE分离内源性O-GlcNAc化蛋白质。：一种。增加或减少细胞中蛋白质O-GlcNAcylation水平。用靶向OGT的siRNA或用对照siRNA转染HEK293细胞，并在有或没有OGA抑制剂Thiamet-G（TMG，10μM，24小时）的情况下培养。使用标准SDS-PAGE分离全细胞裂解物，并通过Western印迹分析。用O-GlcNAc特异性抗体RL2探测细胞蛋白的O-GlcNAcylation水平。肌动蛋白用作上样对照。 B和C.通过WGA-SDS-PAGE分离O-GlcNAc化蛋白质。用靶向OGT的siRNA或用对照siRNA转染HEK293细胞，然后用或不用TMG（10μM，24小时）处理。在WGA-SDS-PAGE（B）或标准SDS-PAGE（C）上分离全细胞裂解物。用抗Nup62（上图）或抗AGFG1抗体（下图）进行免疫印迹。黑色和白色箭头分别表示O-GlcNAcylated和非O-GlcNAcylated形式。基于每个条带的光密度数据计算各个AGFG1形式（No.1-7）与所有条带之和的相对丰度比。黑色支架表示转移到硝酸纤维素膜上的WGA-凝胶层的面积。肌动蛋白用作上样对照。星号（*）表示非特定波段。图像取自Kubota et al。>（2017）。

图3.表位标记的O-GlcNAc化蛋白的检测和分离。在HEK293细胞中用Flag-OGT或Flag-OGA瞬时表达Myc-TFG（A）或Myc-UBAP2L（B），并用抗Myc抗体进行免疫纯化。通过WGA-SDS-PAGE（上图）或标准SDS-PAGE（下图）分离纯化的蛋白质后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并用指定的抗体进行免疫印迹或使用琥珀酰化的WGA探测其O-GlcNAc化。 HRP（sWGA）。使用抗Flag抗体在标准SDS-PAGE中证实Flag-OGT和Flag-OGA在细胞裂解物中的表达。图像取自Kubota et al。>（2017）。

食谱

储备细胞裂解缓冲液（储存在4°C）
20mM Tris-HCl（pH 7.5）
2 mM EDTA
150 mM NaCl
1％Triton X-100
10％甘油
5x SDS-PAGE上样缓冲液（-20°C保存）
325mM Tris-HCl（pH6.8）
25％2-巯基乙醇
50％甘油
15％SDS
125微克/毫升溴酚蓝
库存分离凝胶缓冲液（在R.T.存储）
1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）
0.4％SDS
库存堆积凝胶缓冲液（在R.T.存储）
0.5mM Tris-HCl（pH6.8）
0.4％SDS
转移缓冲液（储存在4°C）
25 mM Tris
192 mM甘氨酸
20％甲醇
10x用于电泳的运行缓冲液（在R.T.存储）
250 mM Tris
1.91 M甘氨酸
1％SDS
TBST
20mM Tris-HCl（pH 7.5）
137 mM NaCl
0.1％吐温-20
一抗解决方案
每种一抗在TBST中稀释
二抗溶液
HRP偶联的二抗在TBST中稀释

致谢

这项工作部分得到日本科学促进会（JSPS）（16H06574和18H02609至M.T .; 25650003和17K08650至Y.K.）的资助。我们感谢P.O'Grady博士对手稿的批判性阅读。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考

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