材料和试剂

纯化的重组蛋白或细胞提取物
RNase抑制剂（Promega Corporation，目录号：N251B）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
酵母总RNA（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9260G）
Tween 20（AM7118）
RNA酶A（Sigma-Aldrich，目录号：R4875）
RNase T1（Epicentre Biotechnologies，目录号：NT09100K）
SDS-PAGE材料
转录优化的5x缓冲液（Promega Corporation，目录号：P118B）
重组RNasin核糖核酸酶抑制剂（20单位）（Promega Corporation，目录号：N251B）
RNase-Free DNase（1单位）（Promega Corporation，目录号：M610A）
[α-^{32 P] UTP（50mCi，10mCi/ml）（IZOTOP）}
Illustra MicroSpin G-50柱（GE Healthcare Life Sciences，目录号：GE-27-5330-02）
T7 RNA聚合酶（20单位）（Promega Corporation，目录号：P207B）
DTT（Promega公司，目录号：P117B）
溴酚蓝
β-巯基乙醇
32标记的RNA探针（参见Recipes）
4x绑定缓冲区（参见配方）
5x蛋白质样品缓冲液（见配方）
竞争对手RNA转录物（参见配方）

设备

37℃和100℃水浴
254-nm UV光源（Stratagene，UV stratoniker ^TM，型号：1800）
SDS-PAGE设备
凝胶干燥器（Bio-Rad Laboratories，型号：583）
成像板（Fujifilm Corporation）
Fujifilm BAS-1500图像分析仪（Fujifilm Corporation，Multi Gauge）

程序

UV交联测定
1. 在冰上制备以下混合物：
  2.5μl4x结合缓冲液
  0.5μlRNA酶抑制剂（10单位/μl）
  1.0μlBSA（1μg/μl）
  1.0μl酵母总RNA（1μg/μl）
  0.5μg纯化的蛋白质 25fmol <32> P标记的RNA探针
  用无核酸酶水将最终体积调节至10μl，并混合反应注意：反应中使用的蛋白质的量取决于RNA结合亲和力。因此，需要测试蛋白质（纯化的或细胞提取物）的量。
2. 在室温（RT）下孵育10分钟
3. 将含有反应混合物的开盖管置于冰上，在UV灯下以254nm波长照射20分钟。
  注意：样品和紫外线源之间的距离约为10厘米。
4. 向反应混合物中加入1μl的10mg/ml的无蛋白酶的RNA酶A和1μl的0.5单位/μlRNaseT1。在37℃孵育30分钟。
  注意：不包括蛋白质添加的反应（如过程1a所示）需要作为阴性对照进行，以确保未结合的RNA探针完全消化。
5. 向反应混合物中加入3μl5x蛋白质样品缓冲液。将样品在沸水浴中孵育5分钟。
6. 用标准SDS-PAGE凝胶电泳分析样品
7. 通过使用Bio-Rad 583型凝胶干燥器干燥凝胶并将成像板置于干燥的凝胶上。暴露一夜，以显示交联蛋白的放射性信号
8. 使用Fujifilm BAS-1500图像分析仪扫描放射性图像。
竞争测定
1. 该程序与上述的UV交联测定相同，除了在加入32 P标记的RNA探针之前将未标记的竞争剂RNA与蛋白质在RT预温育10分钟。
2. 在冰上制备以下混合物：
  2.5μl4x结合缓冲液
  0.5μlRNA酶抑制剂（10单位/μl）
  1.0μlBSA（1μg/μl）
  1.0μl酵母总RNA（1μg/μl）
  0.5μg纯化的蛋白质 50fmole（2x），250fmole（10x）或1,250fmole（50x）竞争RNA。
  用无核酸酶水将最终体积调节至10μl，并混合反应
3. 在RT孵育10分钟。
4. 加入1μl32 sup-标记的RNA探针（25fmol），并在RT孵育10分钟。
5. 以下步骤与上述（来自步骤1c-1h）的UV交联测定相同

食谱

³² P标记的RNA探针制备
在[α-32 P] UTP存在下，用线性化的DNA模板和T7RNA，聚合酶进行体外转录。
1. 在冰上制备以下混合物：
  5μl转录优化的5x缓冲液
  2.5μl100mM DTT
  5μlrNTP混合物（各为10mM的ATP，CTP和GTP，和20μM的UTP）
  0.5μl重组RNasin 核糖核酸酶抑制剂（20单位）
  1μlT7 RNA聚合酶（20单位）
  5μl[α-32 P] UTP（50mCi，10mCi/ml）
  线性化DNA模板（1μg）
  用无核酸酶水将最终体积调节至25μl，并混合反应
2. 在37℃水浴中孵育1小时
3. 加入1μlRQ1 RNase-free DNase（1个单位），并在37℃水浴孵育15分钟。
4. 将混合物装入示意图MicroSpin G-50柱中并在735×g离心2分钟以洗脱标记的转录物并从游离的[α-32 P] UTP螯合。 />
4x结合缓冲液
80mM Tris-Cl（pH8.0） 12mM MgCl 2/
40 mM KCl
8 mM DTT
16％（v/v）甘油
5x蛋白质样品缓冲液
312.5mM Tris-Cl（pH6.8） 50％（v/v）甘油 10％（w/v）SDS
0.1％（w/v）溴酚蓝
12.5％（v/v）β-巯基乙醇
竞争对手RNA转录本
使用线性化的DNA模板和T7RNA聚合酶进行体外转录。
1. 在冰上制备以下混合物：
  10μl转录优化的5x缓冲液
  5μl100 mM DTT
  8μlrNTP混合物（ATP，CTP，GTP和UTP各4mM）
  0.5μl重组RNasin 核糖核酸酶抑制剂（20单位）
  1μlT7 RNA聚合酶（20单位）
  线性化DNA模板（1μg）
  用无核酸酶水将最终体积调节至50μl，并混合反应
2. 在37℃水浴中孵育2小时
3. 加入1μlRQ1 RNase-Free脱氧核糖核酸酶（1个单位），并在37℃℃水浴中孵育15分钟。 />
4. 用苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）纯化RNA转录物，然后用乙醇沉淀RNA。

致谢

该协议改编自我们先前的出版物：Huang等人（2012）。这项研究得到了台湾科学技术部（授予NSC-98-2628-B-005-020-MY3和NSC-98-2811-B-005-030）的支持。

参考文献

Huang，Y.W.，Hu，C.C.，Liou，M.R.，Chang，B.Y.，Tsai，C.H.，Meng，M.，Lin，N.S.and Hsu，Y.H。 Hsp90与病毒RNA特异性相互作用，差异调节竹花叶病毒和相关卫星RNA的复制起始。/a> PLoS Pathog 8（5）：e1002726。