材料和试剂

铝箔（Reynolds Kitchens，REYNOLDS WRAP，目录号：353224）
6孔板（Corning，Falcon，目录号：353224）
12孔板（Corning，Falcon，目录号：353225）
100 x 15 mm方形培养皿（Corning，Falcon，目录号：351112）
14毫升聚丙烯圆底管（康宁，猎鹰，目录号：352059）
电工胶带（ULINE，Hyper Tough，目录号：34366）
野生型拟南芥>（WT，Columbia-0生态型）的玫瑰叶
ire1a ire1b >突变体拟南芥>植物
IRE1b质粒
bZIP60s >， BIP3 >和 Actin2 >特异性引物
用于检测bZIP60s（bZIP60的拼接形式：bZIP60F4和bZIP60SB2）， BIP3 >和 Actin2 >的引物：
bZIP60F4：GAAGGAGACGATGATGCTGTGGCT
bZIPSB2：AGCAGGGAACCCAACAGCAGACT
BIP3F：TTCGACCCGAAACGTCTGATTGGA
BIP3R：GCTTGCCTCTGCGCATCATTGAAA
Actin2F：GGAAGGATCTGTACGGTAAC
Actin2R：GGACCTGCCTCATCATACT
Maxiprep Kit（Gene Elute HP Plasmid）（西格玛奥德里奇，目录号：NA310-1KT）
RNA提取试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit）（QIAGEN，目录号：69104）
cDNA试剂盒（iScript TM cDNA合成试剂盒）（Bio-Rad，目录号：1708890）
Tunicamycin（Tm）（Sigma-Aldrich，目录号：T7765）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：3483-12-3）
PEG4000（PEG）（Sigma-Aldrich，目录号：25322-68-3）
纤维素R-10（Yakult，CELLULASE“ONOZUKAR-10”）
Macerozyme R-10（Yakult，MACEROZYME R-10）
BSA（Sigma-Aldrich，牛血清白蛋白，目录号：9048-46-8）
DMSO（Sigma-Aldrich，二甲基亚砜，目录号：67-68-5）
甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：69-65-8）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：60-24-2）
MgCl 2 （Sigma-Aldrich，氯化镁，目录号：7791-18-6）
MES（Sigma-Aldrich，目录号：4432-31-9）
NaCl（Sigma-Aldrich，氯化钠，目录号：7647-14-5）
CaCl 2 （Sigma-Aldrich，Calcium chloride，目录号：10043-52-4）
KCl（Sigma-Aldrich，氯化钾，目录号：7447-40-7）
KOH（Sigma-Aldrich，氢氧化钾，目录号：1310-58-3）
2x YT介质（参见食谱）
酵母提取物（BD Biosciences，BD Bacto，目录号：212750）
胰蛋白胨（Neogen Food Safety，Acumedia，目录号：7351A）＆nbsp;
酶解决方案（见食谱）
MMg缓冲区（见食谱）
40％PEG（见食谱）
W5解决方案（见食谱）
库存解决方案（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf，Eppendorf Research Plus，目录号：2231000222）
孵化器（New Bruswick Scientific，Innova42，目录号：M1335-0000）
血细胞计数器（Hausserscientific，Bright-Line Counting Chambers，目录号：3100）
显微镜（尼康，Eclipse TS100）
高速离心机（Thermo Scientific，型号：Sorvall TM RC 6 Plus，目录号：36-101-0816）
低速离心机（Thermo Scientific，型号：Hereus TM Multifuge TM X3R，目录号：75004516）
微量离心机（Thermo Scientific，型号：Sorvall TM Legend TM Micro 17，目录号：75002403）
NanoDrop分光光度计（科学工业，型号：Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）
热循环仪（S1000热循环仪）（Bio-Rad，目录号：1852196）
DNA凝胶电泳细胞（Bio-Rad，Sub Cell GT Cell，目录号：1640302，或类似）
DNA凝胶扫描仪（FOTODYNE，FOTO / Analyst ImageTech，目录号：6-9030S2DL，或类似）

软件

ImageJ的＆NBSP;
Adobe Photoshop

程序

制备用于表达目的基因的质粒（IRE1b在该方案中用作实例）。对于每次提取，生长 E.将大肠杆菌在500ml 2x YT培养基中过夜，并使用maxiprep试剂盒（QIAGEN产品）根据制造商的方案进行提取。将DNA浓度设置为1μg/μl。＆nbsp;
所有缓冲液和化学物质应在原生质体转化前至少一天制备（Yoo et al。>，2007）。
用Cellulose R-10和Macerozyme R-10（Yakult的产品）制备新鲜的酶溶液。
从野生型（WT）和/或突变体拟南芥>植物的莲座叶中制备原生质体（Yoo et al。>，2007）（ ire1a ire1b >在本协议中使用如等人>（2009）（图1A-1C）所述的磁带方法作为例子。＆nbsp;
在血细胞计数器中加入10μl细胞悬液，在光学显微镜下计数细胞;将MMg缓冲液中的原生质体重悬至密度为2.5×10 6 sup / ml。
对于每个反应，在2ml圆底管中，将400μl原生质体与30μlIRE1b质粒（1μg/μl）混合，加入等体积的40％PEG（430μl，参见用于制备40％PEG的配方），混合并在室温下孵育10分钟（图1D）。在60 x g >下旋转并用W5洗涤两次以除去PEG。
用1ml W5重悬并将转化的原生质体转移到6孔培养板（或12孔培养板，如果超过6个样品）中，加入W5至终体积为5ml（图1E），并在用箔覆盖黑暗。
通过轻轻移液小心地丢弃上清液（原生质体由于重力而停留在底部，无需离心），并用W5重新悬浮至最终体积为3ml。
将3毫升原生质体平均分成两个2毫升圆底管;将Tm加至5μg/ ml或DTT加至2mM，通过温和倒置混合原生质体，孵育6小时，每2小时混合。
在低速离心机中以60 x g >旋转1分钟，弃去上清液。
加入RNA提取缓冲液（QIAGEN，Plant Mini RNA试剂盒）并彻底涡旋30秒。根据制造商的方案提取RNA。
使用NanoDrop分光光度计测试RNA的浓度和质量;如果需要，RNA可以在-80℃下储存以备后用。
根据制造商的方案（Bio-Rad cDNA试剂盒）使用0.5μgRNA合成cDNA。
使用bZIP60F4和bZIP60SB2引物通过RT-PCR检测 bZIP60 >剪接形式（命名为 bZIP60s >），并使用BIP3F和BIP3引物检测 BIP3 >表达。 Actin2 >（使用Actin2F和Actin2R引物）用作上样对照。
在1.5％琼脂糖凝胶上运行PCR产物，用溴化乙锭染色并在UV光下使用凝胶扫描仪显现（图1F）。如果需要，qRT-PCR可用于定量，针对 Actin2 >进行标准化。

图1.概述拟南芥 > 原生质体分离和转化所得RT-PCR。 A-B。在用酶消化之前（A）和之后（B）用胶带莲座叶离开; C.在W5溶液中分离的原生质体; D.转化过程中的原生质体; E.转移到12孔板后转化的原生质体; F.用或不用2mM DTT处理原生质体样品中的 bZIP60s >和 BIP3 >表达的RT-PCR检测6小时。将IRE1b引入 ire1a ire1b >双突变体背景中，并显示 bZIP60 >剪接和 BIP3 >诱导的恢复。 Actin2 >被用作内源性加载对照。

数据分析

每个实验需要三次独立的转换，如果需要，使用ImageJ（参考文献15）拍摄和量化图像，并通过Student's t > -test评估显着差异。

笔记

所有实验均使用圆底管（大小：2 ml和14 ml）。
为了确保原生质体悬浮液被平均分成两部分，缓慢且一致地移液。
在该测定中， bZIP60 >（ bZIP60s >）的剪接形式的产物很小;建议使用1.5％或更高的凝胶。
如果RNA量低，则将两种转化组合用于每种构建体的RNA提取。
强烈建议使用 ire1a ire1b >双突变体作为对照，因为bZIP60的剪接在该突变体背景中被完全阻断。
为了从莲座叶中分离原生质体，优选在开花前从植物中获得4周龄健康且充分扩展的叶。
PEG / Ca 2 + 溶液用于透化原生质体膜以允许DNA摄取。＆nbsp;
将转化的原生质体置于黑暗中，以尽量减少潜在的轻微压力。

食谱

2x YT媒体
16克/升胰蛋白胨
10克/升酵母提取物
5 g / L NaCl
酶解决方案
1. 使酶溶液新鲜，终浓度为0.4 M甘露醇，20 mM KCl，20 mM MES，1.5％（w / v）纤维素酶
  R-10,0.3％（w / v）macerozyme R-10＆nbsp;
2. 将酶溶液在55°C水浴中加热10分钟，然后冷却至室温，然后加入10 mM CaCl 2 ，
  5mMβ-巯基乙醇和0.1％BSA（w / v）
MMg缓冲区
400 mM甘露醇
15mM MgCl 2
4 mM MES（用KOH调节pH至5.7）
40％PEG
40％PEG4000（w / v）
200 mM甘露醇
100mM CaCl 2，
W5解决方案
154 mM NaCl
125 mM CaCl 2
5 mM KCl
2 mM MES
用KOH将pH调节至5.7
股票解决方案
1. 制备10mg / ml Tm（在DMSO中）和1M DTT（在ddH 2 O）储备溶液中并储存在-20℃。不要将DTT重新冷冻3次以上
2. 制备1M甘露醇，0.3M MgCl 2 ，1M CaCl 2 ，0.5M MES（用KOH调节pH至5.7），1M NaCl，1M KCl储备溶液并保持在室温下

致谢

这项工作得到了国家科学基金会的支持，授予DCB格兰特IOS 1353867。

利益争夺

作者声称该协议没有利益冲突。

参考

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