材料和试剂

移液器吸头（Gilson，产品目录号：F167101，F167103）（储存条件：RT）
Nunc TM 细胞培养用带过滤盖的处理过的烧瓶（Thermo Scientific，目录号：136196）（储存条件：RT）
96孔组织培养板（JET Biofil，目录号：TCP011096）（储存条件：RT）
96孔PCR板（BRAND，目录号：781375）（储存条件：RT）
Parafilm M（Bemis，目录号：HS234526A）（储存条件：RT）
纸巾（任何品牌）
Drosophila S2R + 细胞（DGRC，目录号：150）（储存条件：25°C）
FuGENE ® HD转染试剂（Promega，目录号：E2311）（储存条件：4°C）
Schneider的 Drosophila 培养基（Gibco，目录号：21720024）（储存条件：4°C）
One Shot TM 胎牛血清（Gibco，目录号：A3382001）（储存条件：-20°C）
青霉素 - 链霉素（Gibco，目录号：15070063）（贮存条件：-20°C）
^ pActin-GFP（储存条件：-20°C）
^ pActin-GAl4（储存条件：-20°C）
* shRNA文库（储存条件：-20°C）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco，目录号：20012019）（储存条件：RT）
文化媒体（见食谱）

注意：

^可从Housden实验室获得。＆nbsp;
*可从DRSC（fgr.hms.harvard.edu）或Housden实验室获得。＆nbsp;
RT：室温。

设备

流式细胞仪（Beckman Coulter，型号：CytoFlex S）
25°C培养箱（任何供应商）
组织培养罩（任何供应商）
多通道移液器（Gilson，型号：PIPETMAN ®）
加湿室（N / A）

软件

Matlab（MathWorks）
Excel（微软）

程序

注意：此协议针对 Drosophila S2R + 单元进行了优化。但是，我们希望它可以转移到任何可以有效转染的细胞类型。所有涉及操作培养细胞的步骤都应在合适的组织培养罩中使用无菌技术进行。

用于转染的细胞的制备（或'电镀细胞'）
1. 在培养基中使用标准方法培养细胞，使得它们在转染当天大约80％汇合。
2. 在转染当天，在96孔板的每个孔中，在100μl培养基中铺板1.5×10 4个细胞。
3. 将铺板的细胞置于25℃培养箱中20分钟至1小时，以在加入转染混合物之前进行粘附（参见步骤B3）。
注意：应针对每种细胞类型和生长条件优化细胞的接种密度。
使用FuGENE ® HD转染试剂的转染方案
注意：＆nbsp;
1. 以下转染方案将导致转染混合物超过必要的十倍。这是为了防止需要移液非常小的体积。
2. 虽然我们通常使用FuGENE ® HD试剂，但我们希望此方法适用于任何类似的试剂。
1. 使用每种shRNA以45 ng /μl在水中除霜shRNA文库平板。
  注意：库板应包含阳性和阴性对照试剂，每个试管至少有5个孔，以便评估生成的筛选数据中的噪音。＆nbsp;
2. 在96孔PCR板中，混合90ng shRNA质粒，20ng肌动蛋白-GFP，90ng肌动蛋白-GAL4。
  注意：虽然理论上三种质粒应该一起递送，但是需要更高比例的shRNA与GFP，以最小化用GFP转染细胞但没有相应的shRNA递送的机会。在仅递送shRNA的情况下，细胞将是GFP阴性的，因此在细胞计数期间不会被分析。
3. 加入适量过滤灭菌的PBS，使总体积达到10μl。＆nbsp;
4. 每孔加入0.6μlFuGENE® HD转染试剂，用移液器轻轻混匀。
  注意：将FuGENE ® HD转染试剂直接添加到DNA混合物中。不要让未稀释的试剂接触管的侧面。混合时避免引入气泡。
5. 在室温下在无菌组织培养罩中孵育20分钟。
6. 将1μl转染混合物从PCR板的每个孔转移至细胞培养板，小心不要引入任何气泡。
  注意：通过使边缘孔未被转染来避免边缘效应。＆nbsp;
7. 用Parafilm密封96孔板，并在加湿室中将细胞在25℃下孵育5天。
  注意：简单的加湿室可以用塑料箱或含有湿纸巾的特百惠制成。定期检查以确保纸巾保持湿润，并在必要时加入更多的水。
使用流式细胞仪收集数据
1. 根据制造商的说明初始化和配置流式细胞仪。
2. 调整采集设置以记录每个样本20,000个事件（“所有事件”）。必要时调整增益或激光功率设置，以确保所有事件都在可检测范围内。确保将相同的设置应用于印版中的每个孔。＆nbsp;
3. 按照图2所示的门控策略加载板并获取数据。请注意，加载板，设置门和采集数据的具体方法将根据使用的细胞计数器而变化。遵循制造商的说明以确保适当的设置。有关流式细胞术基础知识的有用解释以及用于分析和解释数据的方法可以在Jaroszeski和Radcliff（1999）中找到。
4. 为所有表达GFP的细胞（门P3）导出.fcs文件以供进一步分析。
  
  图2. VDA检测的门控策略。：一种。通过绘制前向与侧向散射并设置门来选择活动单元，如图所示。 B.通过将前向散射区域与前向散射高度作图来区分单个细胞与双重细胞。 C.通过将GFP荧光（在这种情况下为FITC滤光片）与未使用且光谱不同的滤光片（在这种情况下为APC）作图来鉴定GFP阳性细胞。 D.评估转染效率的统计观点（P3，％父母）。
  注意：VDA不需要非常高的转染效率。然而，低效率（<20％）可能表明不健康的细胞，这可能会影响结果。

数据分析

数据分析需要根据所使用的特定细胞计数器进行定制，因为.fcs文件格式因机器而异。一些细胞计数器可以直接以文本或excel格式导出数据，而其他细胞计数器则需要第三方软件来提取数据。可以在此处获得适用于大多数细胞计数器的Matlab脚本：uk.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fca_readfcs。

如上所述加载.fcs数据。＆nbsp;
提取井位，前向散射（FSC）数据作为细胞大小的代理和来自适当过滤通道的GFP表达数据。＆nbsp;
将每个GFP值除以相应的FSC值，以规范化细胞大小变化。＆nbsp;
根据最小和最大GFP值生成500个箱，并将数据输入箱中，以获得超过GFP强度的细胞分布。＆nbsp;
通过将所有值除以每个样本的值的总和，将每个分布曲线下的面积归一化为1。这样可以消除样本之间可变细胞数的影响。＆nbsp;
生成反向累积GFP分布图（参见图3）。请注意，累积分布的反转主要用于可视化目的，而不是必要步骤。记录每口井的曲线下面积。＆nbsp;

注意：特定于研究中的生物学问题的统计检验可用于确定导致表型与阳性和阴性对照显着不同的RNAi试剂。

笔记

我们建议每个VDA测定板至少设置3个生物学重复。＆nbsp;
从图3中可以看出，VDA应该产生非常明显的曲线。对照试剂（或多次重复使用的试剂）的曲线应非常紧密，几乎在彼此的顶部。可变性可能是由于低转染效率或细胞条件（即，细胞密度或健康状况）。

食谱

文化媒体
500毫升施耐德的媒体
50毫升胎牛血清（FBS）
5毫升青霉素/链霉素
过滤灭菌

致谢

这项工作得到了国防部拨款W81XWH16-1-0127的支持。我们感谢Norbert Perrimon，Stephanie Mohr，Perrimon实验室成员和 Drosophila RNAi筛查中心在开发此处提供的VDA协议方面提供的帮助和支持。该协议根据以前发布的方法进行了优化（Housden et al。，2017）。

利益争夺

作者没有透露任何内容。

参考

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Housden，B.E.，Li，Z.，Kelley，C.，Wang，Y.，Hu，Y.，Valvezan，A.J.，Manning，B.D。and Perrimon，N。（2017）。使用可变剂量分析改进检测 Drosophila 细胞中的合成致死相互作用（ VDA）。 Proc Natl Acad Sci USA 114（50）：E10755-E10762。
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