材料和试剂

定性滤纸，0.22μm，圆形，15 cm（Sangon Biotech（Shanghai）Co.，Ltd。，目录号：F503312）
透析膜（标准，RC，5 KD，18 mm宽度）（BBI，目录号：F128058）
家蚕 Bombyx mori 的茧，由苏州东吴大学蚕业研究所提供，中国。＆nbsp;
Na 2 CO 3 （Sangon Biotech（Shanghai）Co.，Ltd。，目录号：A500840）
CaCl 2 （Sangon Biotech（Shanghai）Co.，Ltd。，目录号：A501330）
乙醇（Sangon Biotech Shanghai Co.，Ltd。，目录号：A500737）＆nbsp;
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：320110）
聚乙二醇-2000（Sangon Biotech（Shanghai）Co.，Ltd。，目录号：A601785）
50 mmol / L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）（见食谱）
Ajisawa的试剂（CaCl 2 /乙醇/ H 2 O [1：2：8摩尔比]）（见食谱）

设备

玻璃注射器，20毫升
玻璃烧杯，50毫升
高速冷冻离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti ® J-30I）
扫描电子显微镜（日立，型号：S-570）
超声波仪器（Sonics Vibra电池）（Sonics＆amp; Materials，型号：VCX 130 PB）

程序

图1显示了使用丙酮制备丝素蛋白纳米颗粒（SFN）或酶包埋SFN的示意图。

图1.使用丙酮制备丝素蛋白纳米颗粒（SFN）或酶包埋SFN的示意图

每次在沸腾的0.2％（w / v）Na 2 CO 3 中将干净的茧壳脱胶两次，每次0.5小时。＆nbsp;
脱胶处理后，在去离子水中反复洗涤所得丝材，然后风干。
将脱胶的丝纤维浸入20倍体积（w / v）的Ajisawa试剂中（CaCl 2 /乙醇/ H 2 O，摩尔比为1：2：8）（Ajisawa，1998）并在70℃（水浴）下搅拌4小时。
将丝素蛋白 - 盐溶液在7,000 x g 离心10分钟，以去除杂质和不溶物质。＆nbsp;
用运行的去离子水连续透析过滤的溶液或上清液48小时，以使用纤维素半透膜（截留值5kDa）除去CaCl 2，，更小的分子和一些杂质。
通过使用PEG将再生丝素蛋白的水溶液在4℃下浓缩至1％-5％的丝素蛋白溶液中，最后将其储存在4℃下用于SFN制备。
如果制备酶包埋的丝素蛋白纳米粒子（SFNs），将一定量的酶（液体或粉末）加入上述丝素蛋白溶液中，并通过手动摇动使混合物温和均匀。＆nbsp;
通过在室温下使用20ml注射器快速将丝素蛋白溶液或与酶的混合物注入丙酮（丙酮超过最终混合物的70％）;当注射进行时，用手快速摇动50ml烧杯或含有蛋白质/酶的容器。＆nbsp;
牛奶状丝蛋白颗粒或酶捕获的丝蛋白颗粒立即形成并悬浮在由水和丙酮组成的混合物中。＆nbsp;
这些颗粒是水不溶性的，并且由于纳米颗粒聚集而可以缓慢沉淀。通过0.22μm滤纸过滤并收集这些纳米颗粒的沉淀物，或通过在108,000 离心下离心0.5小时从混合物中纯化以将颗粒与溶剂分离。＆nbsp;
将这些过滤的渗余物或离心沉淀物进行超声处理（输出功率：16）五次，每次2分钟后，纳米颗粒或酶包埋的纳米颗粒均匀分散在50mM磷酸盐缓冲液或水中，并可在4°C下储存。很长一段时间。

数据分析

我们先前的实验表明，脱胶的丝素蛋白纤维在CaCl 2 三元体系中在70℃下溶解4小时导致丝素蛋白分子链中的酰胺键断裂。 SDS-PAGE显示液体丝素蛋白的分子量和分布受溶解条件的影响（Zhang et al。，2007）。事实上，再生液体丝是逐渐降解的丝素蛋白多肽的混合物，其尺寸范围为约10-70kDa。当将不含或含有L-天冬酰胺酶的给定量的丝素蛋白溶液快速注入过量的丙酮中时，立即形成丝状蛋白质的乳状悬浮液，同时L-天冬酰胺酶紧密地包埋在丝素蛋白纳米粒子（SFN）中。扫描电子显微镜（SEM）观察显示丝纳米粒子是球状颗粒，无论它是否含有酶或没有酶（图2）。所有这些颗粒的直径约为50-120nm。

图2.使用Hitachi S-570扫描电子显微镜观察左侧（SFN）和右侧（L-天冬酰胺酶包埋的SFN）的SEM图像（10 4 x）

食谱

50 mmol / L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）
将7.800g NaH 2 PO 4 •2H 2 O溶解于500ml dH 2 O中，并调节盐用0.1N NaOH溶液调至pH 7.00，最后用dH 2 O将磷酸盐溶液的体积调节至1,000ml
Ajisawa试剂（CaCl 2 /乙醇/ H 2 O [1：2：8摩尔比]）
加入55.5g CaCl 2，至72ml dH 2 ，在混合物溶液冷却至室温后，向混合物中加入57.5ml乙醇。三元溶剂的总体积约为165毫升

致谢

这项工作得到了中国农业研究系统专项基金（CARS-18-ZJ0502）的支持，以及由江苏省高等教育机构优先学术计划发展项目资助的项目。此修改后的协议基于我们之前发表的工作（Zhang et al。，2007和2011）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Ajisawa，A。（1998）。用氯化钙/乙醇水溶液溶解丝素蛋白。< / a> J Seric Sci Jpn 67（2）：91-94。＆nbsp;
Wang，H。Y.和Zhang，Y。Q.（2013）。液体丝素蛋白再生对其结构和表征的影响。 Soft Matter 9（1）：138-145。
Zhang，Y。Q.，Shen，W。D.，Xiang，R。L.，Zhuge，L。J.，Gao，W。J. and Wang，W。B.（2007）。在与水混溶的有机溶剂中形成丝素蛋白纳米粒及其表征。 J Nanopart Res 9（5）：885-900。
Zhang，Y。Q.，Wang，Y。J.，Wang，H.Y.，Zhu，L。和Zhou，Z.Z。（2011）。高效处理丝素蛋白纳米粒子-L-天冬酰胺酶生物共轭物及其作为药物传递系统的表征。 Soft Matter 7（20）：9728-9736。