材料和试剂

注意：除非另有说明，否则物品由一般实验室供应商和兽医或医疗供应商提供。

灭菌物品（高压灭菌或无菌购买）
1. 1毫升注射器（Becton Dickenson，目录号：309659）
2. 测量27针，每只动物3只（Becton Dickenson，目录号：305109）
3. 棉毛球（超市家居品牌）
4. 手术纱布拭子，切成1cm正方形（ProVet，GAUZ HS N1）
5. 小型动物手术窗帘，窗户约2厘米x 4厘米（Theatrewrap，SA）
6. 硅垫（例如，Medline DYNJHOLD1）
7. 方形餐厅级亚麻餐巾（例如，Lunaweddingandeventsupplies.com.au，黑色亚麻餐巾50厘米x 50厘米）
8. 不锈钢仪器盘（例如，仪器概念，KDY8）
9. 手术刀刀片＃11（ProVet，SCAL HS11）（或根据您的喜好）
10. 缝合线[Silkam＃4（AMA，BRAC0762130）或＃6（AMA，BRAC0762113）或您的喜好]
11. 手术手套（ProVet，GLOV CLF7）
12. 蒸馏水（室内，在Schott瓶中高压灭菌）
13. 磷酸盐缓冲盐水pH 7.2（PBS）（内部，在Schott瓶中高压灭菌）
非无菌物品
1. 永久性标记（Officeworks）
2. 含有70％乙醇的喷雾瓶（来自五金店的喷雾瓶，例如，Bunnings）
3. 清洁礼服（ProVet，GOWN S KS）
4. 发套（例如，Medline NONBOUF21）
5. 手术口罩（ProVet，SURG MHS03）
6. 高压灭菌袋（Provet，Henry Schen，各种尺寸，AUTO P HM2; AUTO P HM4）
7. 泡沫包装切成一定尺寸放置在老鼠周围（Officeworks）
8. 胶带（遮蔽胶带，Officeworks）
9. 纸巾（Tork）
10. 管架（Thermo Fisher，21-200-285）
11. 50ml含有70％乙醇的Falcon管（Thermo Fisher，NUN339652）
12. 小培养皿（Thermo Fisher，Sterilin 121V）
13. 70％乙醇
14. 矿脂
生物材料
大鼠[雌性Piebald Viral Glaxo（PVG）大鼠160g +获自动物资源中心（ARC），Canning Vale，WA 6970]
药物
注意：所有药物都通过ProVet（provet.com.au）购买。
1. 氯胺酮[Ketamil，Troy Laboratories，50 mg / kg [50 mg / ml]稀释于磷酸盐缓冲盐水（PBS）]
  注意：Ketamil是一种预定的毒药，应该以适当的安全级别存储。它应避光保存并在室温下储存，并在产品标签上注明有效期。
2. Xylazil [Xylazil，Troy Laboratories，10 mg / kg（10 mg / ml），用PBS稀释（在20-25°C保存，并在标签上注明产品有效期。）]
3. Carprieve（澳大利亚Norbrook，Pty。有限公司;澳大利亚维多利亚州，5 mg / kg（无菌水中5 mg / ml）（在2°C至8°C的温度下避光保存。一旦开放式冷藏保存长达28天。）
4. Luxyl保护眼药水（Tubilux Pharma SpA Via Costarica 20/22 Pomezia意大利）（低于25°C储存。一旦开放式冷冻保存最多60天并立即处理，应该会损害无菌性。）
5. Betadine（500毫升ProVet，BETA AS）（低于25°C储存，避光，观察标签上的任何有效期信息。）

设备

Schott瓶装50-250毫升
手术器械（Kaisers手术器械有限公司）
1. 制表师镊子（一个或两个粗，一个或两个中等和两个细点）
2. 具有朝向彼此向内弯曲以形成“钩”的尖端的中间对也是有用的
3. 精细解剖弹簧剪刀（不同尺寸）
4. 针座或小型Spencer Wells镊子用于缝合
5. 用于切割缝合线的小剪刀
台式高压灭菌器（Siltex，Practica 20L实验室蒸汽灭菌器）＆nbsp;
适用于称重动物的称重秤（例如，Mettler Toledo，MW 1002T / 00）
小型动物剪刀（例如，Wahl KM2）
具有足够工作距离的双目手术/解剖显微镜（例如，尼康，型号：SMZ460）
用于照亮手术部位的光源（例如，Schott，目录号：KL 1500 LED）
Clear Perspex动物支持约。 25 x 10厘米（内部制造;也可从塑料仓库获得）
口棒（通过工程车间制造，图1）（另一种方法是使立杆适应立体定位框架，如WPI 502612）
小型蒸馏器支架和凸台头夹（Labdirect，Kartell蒸馏器支架; Technos凸台头夹）
钻石角膜切开术刀（Geuder，目录号：G-19345）＆nbsp;
小动物热垫（我的宠物仓库，参考文献234016）
备用动物笼用于麻醉诱导期间和/或恢复后
肛门温度计

注意：还需要一个合适的手术台或工作台空间。

图1.不锈钢口棒。 A.口棒由不锈钢棒加工而成。（B）形状滑入口腔，（C）有一个孔，顶部门牙可以通过。 B和C.鼻夹具有弯曲的端部以容纳鼻子并且使用两个螺钉紧固。一个人将夹子压在鼻子上，第二个从鼻夹下方施加轻微的向上压力。

程序

手术前准备
1. 在Schott瓶中高压灭菌水和PBS约。 50-100毫升（可以提前准备并储存）。
2. 高压灭菌手术器械，棉毛球，1厘米 2 纱布拭子，硅器械垫，窗帘，口棒和亚麻餐巾（如果需要）。使用商用高压釜袋并在高压釜循环结束时进行干燥循环。然后可以将物品存放在他们的高压灭菌袋中以备将来使用。
在手术当天
穿戴个人防护装备（PPE），使用无菌/干净的长袍，口罩，发套和手套。如果外科医生也在进行所有术前和术后手术，则必须在手术开始时佩戴新的无菌手套，干净的长袍，帽子和面罩。这可以防止手套或衣服上的任何残留毛皮污染动物周围的伤口和无菌环境。
1. 准备麻醉剂和镇痛剂：
  1. 氯胺酮（Ketamil，Troy Laboratories，50mg / kg; 50mg / ml）与Xylazil（Xylazil，Troy Laboratories，10mg / kg; 50mg / ml;必要时用无菌PBS稀释）组合。
  2. Carpreive（Norbrook Australia，Pty.Ltd .; Victoria，Australia 5 mg / kg; 5 mg / ml，无菌水）
2. 准备动物伦理批准所需的任何文书工作（例如程序表，麻醉记录，术后护理和监测表）。
3. 在恢复区域，打开电热垫并用纸巾盖住。放置无菌PBS，Carprieve镇痛剂，Luxyl（或类似）眼用润滑剂，1ml注射器和27号针头，准备进行术后治疗（图2）。用一支笔来完成所需的文书工作。
  
  图2.术后恢复区。纸巾盖热垫，无菌PBS，镇痛剂，滴眼液，1 ml注射器和针头。
4. 在术前区域，用70％乙醇喷洒工作台表面。准备好小动物剪刀，有机玻璃动物支架，纸巾，泡沫包装毯，胶带，一瓶无菌PBS，一瓶无菌水，无菌纱布拭子（约1 cm 2 ）和无菌棉球（在他们的高压灭菌袋中）和两个小培养皿（图3）。
  
  图3.术前准备区域。动物平衡，快板，聚维酮碘，70％乙醇，小培养皿，无菌PBS，无菌水，棉毛，纱布拭子，有机玻璃动物支持，遮蔽胶带，泡沫包装，永久性标记，笔和程序表。
5. 用70％乙醇喷洒有机玻璃动物支持物并使其干燥。＆nbsp;
6. 将Betadine和70％乙醇置于小培养皿中，准备好剃光后对皮肤进行消毒。
7. 手术台/台式：用70％乙醇喷洒表面和设备。包括脱水器支架和手术过程中可能接触到的任何物体，如显微镜聚焦轮，眼睛片，等。从高压灭菌袋中取出亚麻餐巾，硅器械垫，口棒和器械并安排在蒸馏器支架和显微镜旁边的工作台（图4）。将不锈钢仪器托盘放在卫生巾背面，向其中倒入70％乙醇至足够的深度，以覆盖可能需要放置在那里的任何仪器，缝合线，等。。在后面的地方还有管架和含有70％乙醇的50毫升Falcon管。这用作动物之间缝合器械的容器。从金刚石刀上取下塑料防护装置，压下柱塞，将金刚石从枪管中伸出，但不应超出金属切削深度防护装置。将刀放回盒子中的托架，并用70％乙醇喷洒灭菌（图4）。刀可以吸干或允许风干，但在引入轨道之前必须干燥。刀应该保持在其盒子中朝向亚麻餐巾的背面。
  
  图4.手术要求。无菌亚麻餐巾，硅垫，选择手术和缝合器械，手术刀片，缝合线，金刚石刀，含70％乙醇的不锈钢仪器盘，50毫升含70％乙醇的猎鹰管架，喷雾瓶70％乙醇。
准备开始手术
描述了用于部分横切右视神经的外科手术。（视频1）
1. 称重大鼠，注意程序表上的重量，并根据当地动物伦理委员会的要求，在尾巴上或通过耳朵剪裁识别大鼠。
  注意：如果做多只大鼠，可以在开始手术前对所有动物进行称重和标记。
2. 使用装有27号针头的1ml注射器腹膜内（i.p.）给予适当剂量的麻醉剂，并在诱导期间将大鼠置于单独的笼子中。在动物对脚捏试验没有反应之前不要继续。
3. 准备头部：用小动物剪刀剃须。从耳朵的前部到眼睛和鼻尖之间的中间，优选长冲程。避免损坏胡须。剃须需要靠近皮肤但不要太靠近以致于磨损。
4. 擦拭工作台的表面以去除任何松散的毛发，然后通过首先吹（在垃圾箱上）然后用棉签棉签从前到后擦拭，从动物的头部（包括眼睛）移除尽可能多的修剪毛发。用PBS润湿，直至在棉签上看不到毛发。这很重要，因为伤口或角膜上的皮毛会引起刺激和炎症。
5. 将动物用泡沫包裹物包裹以保暖，用胶带固定包裹物并放在有机玻璃动物支架上。
6. 一旦区域被清除松散的毛皮，手术部位通过三次擦拭交替用70％乙醇和聚维酮碘进行灭菌。将小的纱布拭子浸入70％乙醇中，挤压以除去多余的液体，并沿着剃毛的颅骨沿鼻 - 颞方向擦拭一次。接下来是相同的动作，其中使用betadine拭子继续进行替代应用，直到每次使用betadine擦拭完成三次。重要的是不要让拭子太湿，因为乙醇或聚维酮接触眼睛会导致损伤和发炎。等到皮肤表面干燥后再进行切口。
  注意：在手术过程中，应通过观察呼吸和/或测试脚捏反射来监测麻醉深度。
视频1.部分视神经横断术的视频。该视频是根据美国国家健康与医学研究委员会澳大利亚实践动物保护和使用规范在西澳大利亚大学制作的。用于科学目的，所有程序均经西澳大利亚动物伦理委员会批准，批准号为RA3 / 100/1485。
1. 将动物放在嘴巴上，以支撑头部和显微镜下方的位置，调节光线照亮头部。确保舌头没有被推回口中并且切牙插入杆中的孔中。轻轻拧紧螺丝以固定头部。可以通过旋转凸台夹中的开口杆来调节头部的角度以便于手术。使用第二个盖布覆盖脱水缸支架，以便有一个连续的无菌表面（图5）。
  
  图5.手术设置。：一种。麻醉的大鼠位于嘴巴上;切口是在适合外科医生的手性的任何方向上进行的。 B.位于蒸馏器支架中的口棒，带有有机玻璃鼠支撑和气泡包装，以说明大鼠的位置。 C.放置在脱水缸架上方的手术帘，以在亚麻餐巾和位于大鼠上方的手术单之间形成连续的无菌表面。窗帘中的窗口可以进入右眼和头骨顶部。左边是无菌棉毛和纱布。
2. 将无菌润滑剂涂抹在眼睛上，并用盖布覆盖动物，以便通过窗帘上的窗口可以接触头部和右眼的顶部。
  注意：如果暴露在强光下，可能会损坏眼睛，因此可以通过强度较低的照明来保护眼睛，或者用盖布遮挡，直到皮肤被切开并向前拉过眼睛。
3. 沿着颅骨做一个切口，从中线向右眼略微偏移，略微弯曲。沿着鼻 - 颞轴的切口方向可以适合外科医生的手性。如果皮肤干燥，通常会有较少的出血。
4. 使用粗/中镊子将皮肤保持在切口边缘并向眼睛和眼睛上方拉动，拉伸下面的结缔组织。这也提供了对光源的一些保护，如果需要，现在可以将其打开。
5. 应该可以看到眼睛上方的骨边缘的轮廓，弹簧形剪刀的尖端处于打开位置。将沿着骨骼的尖端沿着鼻缘向左运行约三分之二，以在结缔组织中形成小孔。通过小洞可以看到骨头。
6. 保持剪刀的刀片尽可能靠近骨头，通过切割或钝性解剖，在鼻子和时间上延伸开口 ie ，通过推/拉动作将结缔组织拉离骨头用镊子抓住眼睛边缘的结缔组织（避免损伤眼睛本身）并用剪刀支撑着骨头向前拉。＆nbsp;
7. 使用剪刀轻轻切入颞缘处的面部肌肉，以便现在可以轻松接触眼睛并轻轻向前拉。
  注意：在眼眶侧的骨嵴附近有一条大血管。随着皮肤被向前拉，这会拉伸并进一步远离骨骼。它通常是可见的，所以寻找并避免它。会有轻微的出血，可用小棉签或棉布擦拭。
8. 您现在可以看到眼睛后部被膜包围的泪腺以及从眼睛边缘朝向眼眶后部延伸的表面上的韧带。小血管在这条韧带旁边运行。如果可能的话，在眼睛边缘用虹膜切除术剪刀切开韧带，避开血管。
9. 浅表泪腺需要移到一侧。这是通过用剪刀尖端在眼睛的鼻缘处的周围膜上形成孔并使用剪刀的开口刀片沿其边缘撕开膜来实现的。如果解剖是“钝的”而不是使用剪刀“切割”，小血管会伸展，这是更好的选择。
10. 然后将泪腺压到鼻侧，同时用镊子在颞侧拉伸膜。这样可以使腺体发生偏转，从而可以进入下眼肌和更深的泪腺层。＆nbsp;
11. 膜内的小血管仍应可见穿过薄薄的肌肉层。用钩状镊子捡起肌肉，用剪刀仔细切割，形成一个可以通过打开剪刀刀片加宽的开口。一点一点地，沿着这块肌肉暂时工作，使它完全被切断。在时间轨道上还有另一个大血管，因此需要注意避免这种情况。潜在的泪腺将是可见的。＆nbsp;
12. 需要切割另一块肌肉。它位于上鼻泪腺的皮瓣的“铰链”中。用（钩住）镊子拿起肌肉并一点一点地切开，直到它被切开。
13. 一旦眼外肌被切断，就会看到两个泪腺组织裂片。视神经位于其共同边界之下，有时很难看到。通过将剪刀的刀片平放在原始顶膜内的血管下面并将它们打开穿过腺体表面，可以促使肺叶分离。这种拉伸释放膜附着，并且可以清楚地看到两个叶片。
14. 用镊子轻轻地将肺叶取出，露出下面的视神经。他们会想要恢复到原来的位置，所以双手用镊子挡住腺体，同时通过将镊子尖端放在神经的侧面并轻轻打开尖端，将神经从结缔组织中释放出来。小型弹簧剪刀也可用于切割结缔组织以释放视神经。不要触摸神经本身。
15. 一旦你看到神经周围有空间，你就可以穿过下面的细棉毛吊带。吊带是通过从无菌棉毛球上拉出一小部分并将线圈拧在一起并自身向后扭转而制成的，这样就不会有松散的线缠绕在神经周围。这样可以在切割时支撑神经，但也有助于保持泪腺的恢复。
  使用两对中/细钳。用一对精细的镊子拿起吊带的末端，将末端引入神经的一侧（以适合你的手的方式），同时将第二对钳子放在神经另一侧的空间中。将吊索的末端轻轻推到神经的一侧，并用另一对钳子抓住。一旦抓住，吊索就会通过推拉动作使用两个镊子轻轻喂食，注意不要让神经受到扭转力。吊带通常吸收眼眶内的液体，这有助于润滑神经下方的通道。观察神经并检查它是否扭曲（通过血管旋转表示）。将吊索的末端悬挂在泪腺上以将它们拉回。
16. 在使用细镊子拾取覆盖在视神经头后约1-2mm的视神经上的外鞘之前，增加显微镜的放大倍数。尽量不要切割鞘内可见的较大血管。使用最好的弹簧形式虹膜切除术剪刀，沿着神经纵向做一个小切口;这可以通过进一步切割或拉伸膜来延长。
  注意：不要移除任何膜，只是让它打开以暴露神经。最后一层，软脑膜，非常精细和细腻。这是用最好的镊子拾取的，并用最好的剪刀纵向切割。
17. 一旦神经薄壁组织暴露，撤回镊子并将金刚石刀置于所需的切割深度，由钻石刀突出保护罩后确定。这是使用刀筒上的游标刻度进行调整，刻度上的每个刻度代表10μm（图6）。在我们的手中，将防护装置的突起设置为200μm导致横切约为神经深度的四分之一。如果神经周围有任何积液，则用一小块棉花棉签擦拭。当它不太湿时，神经切割得最好。
  
  图6.金刚石角膜切开术刀显示游标调整，以改变刀片突出部分超出防护范围，从而确定切割深度
18. 保持刀片尽可能垂直（在有限的空间内）将其拉过神经表面，同时通过另一只手拿着带有细镊子的护套或棉质吊带来支撑神经。当鞘被完全取出时，刀易于穿过神经薄壁组织;没有必要施加向下的压力。向下压力压迫神经并导致更深的切口。通过显微镜观察切口，当伤口稍微打开时神经薄壁组织暴露。
19. 然后取出刀，将刀片缩回到护罩内，用乙醇喷洒并放入其支架中，准备进行下一次手术。偶尔有些组织可能粘附在刀片上，在这种情况下，可以在喷洒70％乙醇之前用无菌水冲洗除去。
20. 用一把剪刀（不是很好的）剪掉靠近神经的棉质吊带，这样它就可以从任何一侧抽出而不会在神经上产生扭力。
21. 观察眼眶中自然位置的神经，注意切口与背部的任何偏差。可以将护套轻轻地放回神经上，但不缝合。
22. 检查棉毛或杂散毛皮上没有残留的纤维，并在满意时将下泪腺重新定位在神经上。然后将最浅表的泪腺重新定位在下腺体上。当您从神经中缩小时调整焦点，并仔细检查可能已进入伤口的任何纤维和毛发，并用镊子取出。
23. 可以将内部缝合线放置到位以闭合轨道，但通常是不必要的，因为愈合自然且非常快地发生并且内部缝合线可能是另一种刺激物。偶尔，特别是在没有经验的外科医生中，暴露眼睛后部的开口可能更大，然后可以指示内部缝合线。如果需要内部缝合，则使用＃6螺纹的一个或两个单独缝合线穿过原始结缔组织切口以暴露轨道和覆盖在眼眶边缘上的骨骼上的精细层。最后使用＃4或＃6缝合线缝合皮肤，确保皮肤松弛而不是皱褶，这样可以轻微肿胀。用无菌棉毛轻轻擦拭伤口，去除浅表血。
24. 从口腔中取出动物并转移到恢复区域。用无菌的1cm 2 betadine拭子轻轻擦拭伤口一次，该拭子已挤压过量液体。将1ml无菌PBS皮下皮下注射至腹股沟区域以进行水合，并且皮下注射5mg / kg的卡洛芬镇痛剂。在恢复过程中根据需要将润滑剂滴重新涂抹在眼睛上。有时眼球在手术后从眼眶凸出;用盐水浸湿的棉签轻轻按压可以取代眼睛的正常位置。用凡士林润滑的肛门温度计可用于监测体温。＆nbsp;
25. 根据您的研究所/动物伦理指南监控恢复情况。
26. 当动物半意识转移到温暖的恢复笼（热垫上基座的一半）并根据动物伦理批准中规定的标准继续监测。
  注意：手术成功后，眼睛应保持清晰明亮。由于在打开护套时切断神经，瞳孔在手术期间扩张。然而，瞳孔迅速恢复，通常在第二天被观察到收缩。注意角膜的暗沉，肿胀，出血或浑浊，这可能表明炎症或感染。＆nbsp;

数据分析

组织分析：对于比较分析，假手术程序应包括除打开脑膜和将金刚石刀片拉过神经外的所有内容。在部分视神经横断术后的不同时间，对动物实施安乐死并收集组织。
＆NBSP;安乐死和组织收集的方法取决于实验的性质和要进行的分析。例如，免疫组织化学分析或电子显微镜检查以及随后对视神经切片的免疫反应性或超微结构的半定量分析最好在灌注固定，蔗糖冷冻保护和冷冻切片后进行。在安乐死之前，可以进行视觉功能的行为测试。这些技术超出了本协议的范围，可以从其他来源轻松访问。

笔记

成功的手术对眼睛的外观几乎没有影响。眼睛应该明亮，清晰并且位于轨道中央。应该极其小心地将出血和组织损伤减少到最低限度。进行手术所花费的时间也会产生影响。镜片变得缺氧和不透明，尽管这通常在恢复期间反转。练习提高技能和速度。通过使用小棉绒拭子可以减少手术中的出血。
恢复后出现的并发症通常是由于周围结缔组织，肌肉和泪液组织的过度损伤引起的。眼睛可能从眼眶凸出，未对准或变钝。边缘周围可能有干血。眼睛的血液供应减少会导致视网膜变性和晶状体混浊。眼内的任何血液都表明出血。
如果无菌技术不充分，可能会发生感染。角膜上的暗沉薄膜或角膜上凸起的不透明区域可能表明感染。在三次擦拭技术和缝合以使边缘对齐之后，伤口通常能够快速且干净地愈合。伤口边缘最初会出现轻微炎症，但应保持清洁，无脓或出血。
眼睛周围的严重肿胀可能表明眼眶内有异物，如棉毛。在关闭伤口之前，请仔细检查并去除所有纤维和任何毛发。＆nbsp;
偶尔缝合线可能会因笼子交配或刮擦而“脱落”，这可能导致皮肤伤口重新打开。划痕可能表明感染或缝线过紧。缝线应该“放松”以允许发生轻微的肿胀。道德规范应允许动物重新麻醉并在必要时重新缝合。

致谢

MF由NHMRC职业发展奖学金（APP1087114）提供支持。

利益争夺

没有利益冲突或竞争利益。

伦理

所有涉及动物的程序均经西澳大利亚动物伦理委员会批准，批准号为RA3 / 100/1485，并遵守国家健康和医学研究委员会澳大利亚行为准则，以便为科学目的照顾和使用动物。

参考

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