材料和试剂

结核分枝杆菌（ M huberculosis ）H37Rv
甘油
正磷酸二氢钾（无水）
硫酸镁（7H 2 O）
柠檬酸
硫酸铁铵
谷氨酸钠
酪蛋白水解物
Milli Q水
叠氮化钠
BCA测定试剂盒（Pierce Antibodies，目录号：23252）
蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：05-056-489-001）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）
尿素
digitonin（Sigma-Aldrich，目录号：D141-100MG）
CHAPS
载体两性电解质
6x SDS样品缓冲液
玻璃珠
蛋白质透析袋（Thermo Fisher Scientific，目录号：88244）
麦卡特尼瓶
微孔过滤器（0.22微米）（EMD Millipore，目录号：SLAP02550）
Sauton的液体介质（见配方）

设备

离心机
磁力搅拌器
准备制备等电聚焦（IEF）细胞（Bio-Rad Laboratories，Rotofor，目录号：170-2906）
Model 491 Prep Cell（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-2926）
细菌孵化器
蛋白浓缩器3kDa截留 - 搅拌细胞（Life Technologies，Ambion ，目录号：5123）
循环水浴
3mm单玻璃珠

程序

来自结核分枝杆菌的培养物滤液抗原的制备
1. 结核分枝杆菌H37Rv菌落从Lowenstein Jensen（LJ）斜面转移到2ml Sauton's液体培养基中。 LJ介质在M中广泛使用。结核病培养并含有甘油，孔雀石绿，凝固的蛋并倒入麦卡特尼瓶中固化。细菌团块用2ml LB培养基和3mm单玻璃珠处理，短暂涡旋并短暂地以低速旋转悬浮液或使其不受干扰几分钟以使团块沉降并转移含有用于培养的细菌的上清液。
2. 然后将细菌细胞悬浮液转移到在McCartney瓶中的10ml Sauton液体培养基中，在37℃下孵育2周。
3. 然后将杆菌转移到200ml Sauton's液体培养基中，并作为振荡培养物生长4周。来自对数期培养的接种物通常以1/100稀释度加入培养基中以繁殖大体积分枝杆菌培养物。
4. 将对数期细胞再次转移到含有1.5L Sauton培养基的4L培养瓶中，并在37℃下生长为静止培养物四周。
5. 分枝杆菌细胞在此期间继续繁殖并形成表面薄膜
6. 通过在5,000rpm（3,000xg）离心30分钟收集培养物中的杆菌。
7. 使用Millipore过滤器（0.22微米）对培养物上清液进行无菌过滤以确保完全去除杆菌，并将含有培养物滤液抗原的上清液浓缩在搅拌槽中使用3kDa截止膜
8. 使用BCA测定试剂盒估计培养物滤液抗原中的蛋白质含量
9. 然后将抗原与叠氮化钠（0.002％）和蛋白酶抑制剂PMSF一起分配到较小体积中，最终浓度为每毫升2mM。
10. 然后将培养物滤过抗原（CFA）储存在-70℃下备用。将其用作纯化38kDa和30kDa抗原的起始材料
通过二维制备电泳纯化结核分枝杆菌的38kDa抗原。
1. 纯化38 kDa抗原
  M的38kDa脂蛋白。肺结核H37Rv CFA通过二维电泳（2-D）纯化。第一维分离基于使用制备性等电聚焦技术的蛋白质的pI值，随后是制备性SDS-PAGE，其中蛋白质基于分离的其分子量二维制备电泳（2-D）
  1. 透明等电聚焦
    基于所有蛋白质具有pH依赖性净电荷的事实，将预备IEF细胞用于蛋白质的第一维分离。在电聚焦过程中，蛋白质在其中蛋白质上的净电荷为零的确定的pH梯度中以其各自的等电点浓缩在离散的液体部分中。
    1. 样品准备
      整个M。肺结核H37Rv CFA（100mg）对Milli Q水（4L，用3-4次改变的水建议间隔3-4小时）透析过夜，然后用4M尿素（13.2g），0.2％将去甲肾上腺素（137.5mg的80％储备液），0.2％CHAPS（110mg），10％甘油（5.5ml）和1％载体两性电解质pH范围4-6（0.5ml）。最终体积用Milli Q水补足至55ml
    2. 实验条件
      将样品加载到准备型IEF电池上，并在室温下在12W恒定功率下进行聚焦4-5小时，同时通过循环冷水浴提供冷却。根据制造商的说明，Rotofor电池必须在冷却下运行，否则可能发生过度加热，损坏设备。建议使用冷冻循环水浴将冷却液温度保持在4°C。初始条件为500V和20mA（30分钟）。在平衡（4-5小时）时，条件为1,200V和10mA。收集每份2.5ml的20个级分，测量其pH，并通过SDS-PAGE分析其多肽组成
  2. 配方SDS-PAGE
    使用Model 491 Prep Cell进行连续洗脱电泳。在运行期间，将样品通过圆柱形SDS-PAGE进行电泳。优化后，使用10％凝胶，其中38kDa蛋白质的RF（相对前沿）值在0.55-0.6之间。
    1. 样品准备
      合并含有38kDa抗原的级分，在4℃下对蒸馏水进行大量透析。将浓缩至2.5ml的蛋白质溶于0.5ml 6×SDS样品缓冲液（6×SDS样品缓冲液：0.35M Tris HCl（pH6.8），10％SDS，30％甘油，9.3％ DTT，不要弥补体积），并应用于模型491 Prepcell进行纯化
    2. 实验条件
      施加的样品总体积：3ml
      溶解凝胶的百分比：10％
      分辨胶的高度：6厘米
      堆叠胶的百分比：4％
      堆叠凝胶高度：1.5厘米
      运行缓冲液：25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％SDS 洗脱缓冲液：PBS（0.01M，pH7-7.2）
      运行条件：12 W，8 h
  3. 在溴酚蓝色跟踪染料洗脱后，以1.5ml/min的速率收集级分。通过SDS-PAGE分析每十个级分的多肽组合物。当鉴定了感兴趣蛋白质的区域时，分析该区域内的每个部分以确定污染水平。合并含有纯化的38kDa抗原的级分并浓缩

食谱

Sauton的液体培养基

甘油	30 ml
磷酸二氢二钾（无水）	0.5克
硫酸镁（7H 2 O）	0.5克
柠檬酸	2.0克
硫酸铁铵	0.05 g
谷氨酸钠	4.0克
酪蛋白水解物	500毫克
Milli Q水	950 ml

将介质的组分混合并使用磁力搅拌器完全溶解。用40％氢氧化钾（KOH）（需要约5ml的40％KOH）将培养基调节至pH 7.2。然后用Milli Q水将培养基补足至1L，并以15磅/平方英寸的压力灭菌20分钟

致谢

该方案由Uma Devi等人（2001）的原始出版物提取。这项工作得到了Indo US VAP& DBT印度授予Dr. Alamelu Raja博士。

参考文献

Senthil Kumar，K.S.，Uma Devi，K.R.and Alamelu，R。（2002）。隔离和评估结核分枝杆菌的两种主要分泌蛋白的诊断价值。 Indian J Chest Dis Allied Sci 44（4）：225-232。
Uma Devi，K.R.，Kumar，K.S.，Ramalingam，B.and Alamelu，R。（2002）。分枝杆菌的三种免疫显性蛋白（38,30和16 kDa）的纯化和表征肺结核。 Protein Expr Purif 24（2）：188-195。
Uma Devi，K.R.，Ramalingam，B.，Brennan，P.J.，Narayanan，P.R.and Raja，A。（2001）。特异性和早期检测IgG，IgA和IgM抗体肺结核病中的结核分枝杆菌 38 kDa抗原结核病（Edinb） 81（3）：249-253。