材料和试剂

Millex ® -GP过滤单元：Millipore Express ® PES膜0.22μm（Merk Millipore Ltd.，目录号：SLGP033RS）
细网金属筛（无特定品牌）（2x）
铝箔（没有特定品牌）
50 ml离心管，CentriStar TM 帽，聚丙烯，RNase- / DNase-free，Nonpprogenic（Corning Science Mexico，目录号：430921）＆nbsp;
15 ml离心管，CentriStar TM 帽，聚丙烯，RNase- / DNase-free，Nonpprogenic（Corning Science Mexico，目录号：430791）
2 ml微量离心管分级天然RNase- / DNase-free（Fisher Scientific，目录号：05-408-138）
1,000μl移液器吸头（无特定品牌）
200μl移液器吸头（无特定品牌）
细砂，例如，用于操场和沙坑（沙子可以高压灭菌用于生物防护设施）
C57BL6 / J小鼠品系和/或菌株和感兴趣的品系＆nbsp;
Eimeria vermiformis （不可商购）
无菌自来水
次氯酸钠14％C12水溶液（VWR CHEMICALS，目录号：27900.365）（室温）
氯化钠（NaCl）（Merck KGaA，目录号：1。06404.1000）（室温）
重铬酸钾（Cr 2 K 2 O 2 ）（VWR，目录号：26784.297）
冰箱（没有特定品牌）

设备

Fuchs-Rosenthal Counting Chamber（MARIENFELD，目录号：0640410）
双室McMaster计数室（CHALEX，LLC： www.vetslides.com ）
漏斗（没有特定品牌）
1 L烧杯（没有特定品牌）
P1000移液器（无特定品牌）
P200移液器（无特定品牌）
磁力搅拌器（VELP Scientifica，型号：F20500162）
通风橱（Burdinola，型号：OR-ST-1500）
水族箱泵（没有特定品牌，例如，1 W静音泵）
离心机（Eppendorf AG，22331 Hamburg，型号：5810 R）
Grant-Bio Vortex，PV-1（Grant Instruments Ltd）
显微镜（尼康，日本，型号：SE）
倒置显微镜（欧盟进口商 - Carl Zeiss Microscopy GmbH，型号：Primovert，目录号：415519-1100-）

程序

准备 E. vermiformis 股票
1. 用 E感染小鼠。通过口服强饲法在100μl自来水中加入vermiformis （1,000个卵囊）。＆nbsp;
2. 在感染后第8天，将小鼠置于衬有沙子的笼子中（参见方法B和图3）。
  注意：感染的易感性和通畅性取决于小鼠的菌株，应根据经验进行测试。此处描述的方案是C57BL6 / J小鼠品系的典型方案。＆nbsp;
3. 在感染后第9天，从含有5只感染动物的笼子中收集小鼠粪便。＆nbsp;
4. 将粪便放入50毫升Falcon管中，加入40毫升无菌水并涡旋直至粪便解聚。存放在冰箱中（2-6°C）。
  注意：使用更严酷的方法（如玻璃珠）可能会损坏寄生虫。
5. 在感染后第10天和第11天重复步骤A3-A4。
6. 准备好准备原料时，将三个Falcon管的内容物通过细网筛倒入烧杯中（以去除较大的碎片）。
7. 在通风橱中工作，加入180毫升4％重铬酸钾溶液（w / v），最终浓度为2.4％（3 x 40 ml + 180 ml = 300 ml终体积）。
8. 向烧杯中加入搅拌棒并置于磁力搅拌器上。使用低水位的水族箱泵对内容物进行充气，足以连续产生一些气泡。
9. 用铝箔盖上烧杯以减少蒸发。
10. 将泵打开并在室温下在通风橱中搅拌三天。定期检查搅拌器和通风。
11. 三天后，取样并在Fuchs Rosenthal室中计数卵囊以检查孢子形成的百分比（参见程序C和图2）。如果孢子形成低于70％，则将溶液再保留一天，并在第二天或之后的第二天（如果需要）重复计数和孢子形成评估（通常需要4-5天）。
12. 一旦孢子形成的百分比高于70％，将储备溶液放入冰箱。记下卵囊的近似浓度，以备将来参考。
  
  图2. E. vermiformis 卵囊。这个图说明了如何“区分孢子形成的卵囊”。 A.未呕吐或早期卵囊。 B.孢子形成或晚期卵囊，其为四孢子，其中可见四个孢子囊。在Primovert显微镜下记录，以400x放大倍数（Ocular 10x +物镜40x）拍摄。比例尺=20μm。
准备 E. vermiformis 感染老鼠
1. 从 E转移含有卵囊的适当体积。将vermiformis 原液（参见程序A）加入15 ml Falcon试管中。
  注意：
  1. 通常，储备溶液含有约1 x 10 5 卵囊/ ml。
  2. 适当的体积取决于您希望感染的小鼠数量和获得的储备溶液。＆nbsp;
2. 用无菌水填充至15毫升，并在室温下以1,800 x g 离心8分钟。＆nbsp;
3. 弃去上清液并涡旋，将颗粒从Falcon管的底部分离。＆nbsp;
4. 用无菌水再次填充至15ml并重复洗涤步骤两次。
  注意：通常情况下，上清液会从淡黄色变为清澈。
5. 弃去上清液，涡旋沉淀并用次氯酸钠填充至15ml。
  注意：重要的是将颗粒彻底重新悬浮在次氯酸钠中，因为卵囊位于底部，需要漂浮到次氯酸钠的顶部。使用涡旋混合。＆nbsp;
6. 在室温下以1,100 x g 离心10分钟，低断裂（设定1）。从离心机中小心地取出管子，小心地从表面环上取下1-2毫升，然后转移到干净的15毫升Falcon管中。
  注意：对于前1-2毫升，您可能会发现眼睛有轻微的浑浊。
7. 可选：取出顶部1-2毫升（步骤B6）后，再次用次氯酸钠填充，涡旋重新悬浮沉淀，重复离心10分钟，在1,100 xg ，低断裂，在室温下。从表面环中加入1ml至15ml Falcon管中先前收集的1-2ml。
8. 将含有2-3ml卵囊的试管用无菌水填充至15ml，并在室温下以1,800 x g 离心8分钟。＆nbsp;
9. 弃去上清液，再用无菌水再充满15毫升。再重复两次洗涤步骤。＆nbsp;
10. 在最后的洗涤步骤中，弃去上清液并将沉淀重新悬浮在1ml无菌过滤的自来水中。＆nbsp;
计算孢子形成的卵囊感染小鼠
1. 稀释先前准备的 E. vermiformis 使用10x物镜计算Fuchs Rosenthal Chamber 0.200 mm深度（图3）。
  
  图3. Fuchs Rosenthal计数室。：一种。双室计数载玻片（0.200mm深度; 0.0625mm 2 ）。 B.总的来说，网格包含16个1毫米边的大正方形，由三条线包围。所有16个大方块被细分为16个0.25mm侧的小方块。由于计数网格较大，深度为0.2 mm，总体积为3.2μl，因此腔室系数为312.5。
2. 计算16个大方块中的孢子形成的卵囊，并乘以室因子312.5（0.2mm高度;体积3.2μl）并稀释以获得孢子形成的卵囊数/ ml。
  例如，60个孢子形成的卵囊x 312.5 x 10（稀释1:10）= 187,500个卵囊/ ml = 1.875 x 10 5 卵囊/ ml
  注意：参见图2，区分孢子形成和未形成孢子的卵囊。＆nbsp;
3. 调整到所需的卵囊数/ ml。
  例如，100μl中的1,000个卵囊/小鼠。从前面的例子中，准备1毫升浓度为1×10 4 卵囊/ ml：
  来自制备的 E的1,000μl/ 1.875×10 5个卵囊x 10,000个卵囊=53.3μl。 vermiformis 溶液+946.7μl无菌过滤自来水
  注意：准备额外的体积以解释灌胃针的体积损失。准备好的 E。 vermiformis 溶液可以在冰箱中保存过夜。
4. 通过口服管饲法（标准小鼠大小）给每只小鼠100μl。
确定小鼠粪便中的卵囊负担
1. 在感染后第6天，将每只小鼠单独放入衬有细沙（例如，操场上的沙子）的笼子中。
  注意：使用一层薄薄的沙子，足以覆盖笼子的底部（图4）。
  
  图4.鼠标放置在内衬细沙的单独通风笼（IVC）中
2. 在第7天，从每只笼子中的每只小鼠收集带有粪便的沙子。使用筛子将沙子与粪便分开，并使用漏斗将粪便转移到50ml Falcon管中。将笼子放在干净的沙子上并将鼠标放回笼子中。
3. 向Falcon管中加入30ml无菌水并涡旋1分钟。在卵囊计数之前，样品可以在冰箱中储存长达6个月。
4. 每天重复步骤C2和C3，直到不再检测到卵囊（在C57BL6 / J小鼠中15-16天）连续两天以确定通畅（卵囊脱落的天数）和卵囊的累积数量。＆nbsp;
5. 或者，如果小鼠品系或测试条件之间的通畅期相似，并且由于大多数卵囊在第8-10天之间脱落，可以选择并报告较短的确定时期。
计算受感染小鼠粪便中的总卵囊数量
1. 为了计数，在一天内剧烈地将含有粪便的50ml Falcon管在30ml体积的单个小鼠中涡旋以解聚粪便。
2. 在饱和氯化钠中制备3个独立稀释液（最终体积1 ml，例如，稀释1：10-100μl粪便+900μl氯化钠）。
  注意：切割200和1,000μl吸头（1 cm）的尖端非常重要，以便从样品中吸取并转移粪便。
3. 调整稀释度，计算每个计数室中最多100个卵囊。
  注意：在感染高峰期会遇到更高的卵囊数。准备连续稀释液，不超过3个稀释步骤（参见表1）。
  
  表1.稀释指南 E.小鼠粪便中的vermiformis 可以计入McMaster Chamber。稀释取决于感染后的一天（d.p.i.）。这些稀释液代表感染1,000个卵囊的C57BL6 / J小鼠。＆nbsp;
4. 填满McMaster计数室（图5），等待~2分钟，让卵囊在饱和氯化钠溶液中漂浮。
  
  图5.双室麦克马斯特计数载玻片。 0.15厘米深度; 1厘米 2 。
5. 使用10x物镜计算网格区域内的总卵囊（包括左侧和顶部网格线上的卵囊）。
6. 取三次计数的平均值并乘以稀释因子（室容积150μl，原始体积30ml;稀释倍数为200x）以及用于获得卵囊总数/小鼠/天的任何其他稀释液（图6）。
  公式：从三个室计算的卵囊平均值×200倍额外稀释度=每天卵囊数/小鼠数
  
  图6.C57BL6 / J小鼠的特征性卵囊负荷。小鼠粪便中的卵囊数量接种了1000个孢子形成的卵囊 E. vermiformis 。每个时间点分析三只动物。误差棒显示平均值的标准误差（SEM）。

致谢

这项工作得到了欧盟H2020 ERA项目（编号667824-EXCELLtoINNOV）的支持，该项目用于Veldhoen实验室和FundaçãoparaaCiênciaea Tecnologia（FCT）学生SFRH / BD / 131605/2017到P.F-C的工作。作者要感谢Ana Figueiredo Duarte设计图1.
这里描述的方法的应用可以在参考文献Konjar 等人（2018）中找到。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

伦理

所有动物实验均符合葡萄牙Diretrão-Geral deAlimentaçãoeVeterinária的规定以及Instituto de Medicina Molecular的当地伦理审查委员会和指南。 JoãoLoboAntunes。

参考

Fayer，R。（1980）。原生动物感染的流行病学：球虫病。兽医寄生虫 6（1）：75-103。
Konjar，Š。，Frising，UC，Ferreira，C.，Hinterleitner，R.，Mayassi，T.，Zhang，Q.，Blankenhaus，B.，Haberman，N.，Loo，Y。，Guedes，J.，Baptista ，M.，Innocentin，S.，Stange，J.，Strathdee，D.，Jabri，B。和Veldhoen，M。（2018）。线粒体维持上皮细胞驻留T淋巴细胞的受控活化状态。 Sci Immunol 3（24）：eaan2543。
Long，P.L.，Millard，B.J.，Joyner，L.P。和Norton，C.C。（1976）。用于研究和诊断禽球虫病的实验室技术指南。 Folia Vet Lat 6（3）：201-217。＆nbsp;
Munot，K。和Kotler，D。P.（2016）。小肠感染。 Curr Gastroenterol Rep 18（6 ）：31。
Ramsburg，E.，Tigelaar，R.，Craft，J。和Hayday，A。（2003）。针对肠道寄生虫的初级但非次级保护性免疫应答中gammadelta T细胞的年龄依赖性要求。 J Exp Med 198（9）：1403-1414。
Roberts，S.J.，Smith，A.L.，West，A.B.，Wen，L.，Findly，R.C.，Owen，M.J。和Hayday，A.C。（1996）。 T细胞alpha beta +和gamma delta +缺陷小鼠显示异常但不同的自然表型，广泛感染肠上皮细胞。 Proc Natl Acad Sci USA 93（21）：11774-11779。