材料和试剂

微管1.5 ml（Axygen，Maxyclear，目录号：MCT-150-C-S）
离心管15 ml（Corning，目录号：CLS430791）
离心管50 ml（Corning，目录号：CLS430290）
培养瓶25厘米 2 （康宁，斜颈，帽塞密封，目录号：CLS430168）
注射器过滤器0.22μm（Sartori，Minisart注射器过滤器，目录号：16534）
微量移液器吸头，10μl，200μl和1,000μl（Axygen，目录号：T-300，T-200-Y和T-1000-B）
血清移液器，10 ml（Costar Sterile，目录号：4488）
显微镜载玻片（Knittel玻璃，非彩色，目录号：VA111101FKB.01）
盖玻片（Knitell玻璃，22 x 22 mm，目录号：VD12222Y1A.01）
塑料盖玻片（使用切割塑料袋作为粘合剂）
吨。 cruzi 细胞系：Y株（TcII）和CL Brener株（TcIV）
5'-Iodo-2'-deoxyuridine（IdU）（Sigma-Aldrich，目录号：I7125）
5'-氯-2'-脱氧尿苷（CldU）（艾博抗（上海），目录号：ab213715）
小鼠α-IdU单克隆抗体（BD，目录号：347580）
大鼠α-CldU单克隆抗体（Accurate，目录号：YSRTMCA2060GA）
山羊α-小鼠IgG1二抗，Alexa Fluor 568（Thermo Scientific，目录号：A-21124）
山羊α-大鼠IgG（H + L）二抗，Alexa Fluor 488（Thermo Scientific，目录号：A-11006）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
聚L-赖氨酸盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P2658）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：05470）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
Na 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：255793）
KH 2 PO 4 （默克，目录号：104873）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
肝脏输液汤（BD，目录号：226920）
Tryptose（Sigma-Aldrich，目录号：70937）
Hemin（Sigma-Aldrich，目录号：H9039）
三乙醇胺（Sigma-Aldrich，目录号：90279）
胎牛血清（Fisher Scientific，目录号：10500056）
青霉素G钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：13752）
硫酸链霉素盐（Sigma-Aldrich，目录号：S9137）
硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
四硼酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：221732）
NaOH（默克，目录号：1064980500）
带DAPI的Vectashield安装介质（Vector Labs，目录号：H-1200）
盐酸发烟率37％（默克，目录号：100317）
指甲油（任何品牌，最好是无色）
碱化水（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）（见食谱）
肝脏输注胰蛋白酶（LIT）培养基（见食谱）
5'-氯-2'-脱氧尿苷溶液（CldU-S）（见食谱）
5'-碘-2'-脱氧尿苷溶液（IdU-S）（见食谱）
固定缓冲液（FB）（见食谱）
聚L-赖氨酸溶液（PLS）（见食谱）
透化解决方案（PS）（见食谱）
变性缓冲液（DB）（见食谱）
中和缓冲液（NB）（见食谱）
阻断解决方案（BS）（见食谱）

设备

微量离心机（Eppendorf，型号：5424 R）
电动移液器（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：03-692-172）
水浴（Cientec，型号：CT-226）
孵化器BOD（Vitrex，型号：NI1705）
荧光显微镜[奥林巴斯，型号：BX51，耦合到XM10数码相机。滤波器规格：U-MWU2（激发= 330-385nm;发射= 420nm），U-MWIBA3（激发= 460-495nm;发射= 510-550nm）和U-MWG2（激发= 510-550nm） ;发射= 590 nm）]
微量吸管（Gilson，型号：Pipetman P10，P20，P200和P1000）
离心机（Eppendorf，型号：5810 R），配备4 x 250 ml摆动式转子
带盖玻片的Neubauer室（Sigma-Aldrich，型号：Bright-Line TM Hemacytometer）
生物安全II级A2柜（Pachane，型号：PA 700）
pH计（Gehaka，型号：PG1800）
高压灭菌器

软件

Olympus Cell F软件（Olympus，版本5.1.2640）
ImageJ（NIH，版本1.47t）
Microsoft Excel（Microsoft Office-任何版本）或GraphPad Prism（GraphPad软件公司）

程序

- 在开始使用此协议之前，我们建议您完全阅读它，尤其是本文末尾的“注释”部分。
- 细胞应在适合给定细胞类型的培养基和生长条件下培养。为了在数据分析期间获得合适数量的标记细胞，它们必须处于指数期。
- 虽然胸苷类似物在高剂量长时间使用时可能有毒，但我们没有发现我们的 T中有关毒性的任何改变。在我们的分析过程中，cruzi 细胞系。
- 重要提示：如果此方案中使用的抗体之前未进行特异性检测，我们强烈建议首先进行步骤B（检查抗体特异性的对照）。

DNA交换分析
1. 孵育 T. cruzi 细胞（28℃）直至它们在10ml培养物中达到指数期（~1×10 7 细胞/ ml）。寄生虫密度根据使用的谱系而变化。
  注意：在我们的分析中，我们使用了两种不同的谱系： T. cruzi Y菌株（TcII）和 T.克鲁兹 CL Brener菌株（TcIV），均为epimastigote形式。指数期可能因每种菌株而异。
2. 拆分指数 T。将cruzi培养物加入两个培养瓶（25cm 2 ）中，每瓶加入5ml。
3. 在室温下解冻胸苷类似物CldU-S和IdU-S的两种溶液。
4. 在一个烧瓶中加入一种胸苷类似物（例如，CldU）至终浓度为100μM，另一个烧瓶中加入另一个（例如，IdU），最终浓度为100μM。＆nbsp;
5. 将含有不同胸苷类似物的每个烧瓶在28℃孵育12小时。
  注意：孵育时间以及温度可能因每种寄生虫菌株或细胞类型而异。在我们的方案中，孵育时间（胸苷类似物掺入的时间）在经过长时间的测试后凭经验确定。我们设法使用相当于所用谱系倍增时间的一半的时间段获得了良好的结果（ T. cruzi 倍增时间为24小时）。＆nbsp;
6. 在28℃温热等分试样的200ml肝输注胰蛋白酶（LIT）培养基。
  注意：如果可以，请使用水浴。
7. 收集5毫升 T。 cruz 寄生虫CldU-或IdU-通过在800 x g 离心5分钟（来自步骤A6）而掺入。＆nbsp;
8. 小心地从细胞中取出培养基，并在28°C下用10 ml LIT替换。
9. 小心地悬浮颗粒并重复步骤A7-A8两次，用LIT进行总共三次洗涤。对于最后一次洗涤，小心地将沉淀物悬浮于5ml LIT中。
10. 混合使用CldU和IdU的 T。将cruzi 培养物放入一个烧瓶中，总体积为10ml。
11. 在28°C孵育24小时。
  注意：孵育时间以及温度可能因每种寄生虫菌株或细胞类型而异。
12. 将1x PBS冷却至4°C。
13. 通过在4℃下以800×g离心5分钟收获细胞，并使用5ml冷的1x PBS洗涤两次。
14. 小心地从细胞中取出1x PBS以保存沉淀。
15. 将沉淀悬浮于1ml冷固定缓冲液（FB）中，并转移至1.5ml微量离心管中。
16. 在4℃下孵育7分钟，并使用5ml冷的1x PBS（每次洗涤中800μl离心5分钟，每次洗涤5分钟）洗涤三次。对于最后一次洗涤，将沉淀小心地悬浮在500μl的1x PBS中。如果颗粒太小（即，肉眼几乎看不见），则将最后一次清洗的体积减少到100μl的1x PBS。
17. 准备幻灯片以接收 T。通过将2.5μl聚-L-赖氨酸溶液（PLS）铺展到载玻片表面上直至PLS变干，克鲁兹细胞。为步骤A15中的每个样品准备三个载玻片。
  注意：使用盖玻片帮助将PLS传播到幻灯片上（有关详细信息，请参见图1）。
  
  图1.澄清步骤A17的插图。盖玻片可用于帮助将PLS液滴（2.5μl）分散到载玻片上。
18. 在三个载玻片的每一个中小心地散布悬浮颗粒（来自步骤A16）。使用25-30μl并保存剩余的悬浮颗粒体积，以备您需要重新制作某些幻灯片时使用。
  注意：＆nbsp;
  1. 使用PLS之前传播的相同表面。
  2. 每张幻灯片都是一个技术副本。
19. 等待细胞沉淀并在室温下在载玻片上沉降10-15分钟。确保细胞不会变干。
20. 通过在室温下加入50μl渗透固化溶液（PS）10分钟来使细胞透化。
21. 使用1x PBS洗涤含有细胞的载玻片三次。
  注意：使用P1000微量移液管将1x PBS（1 ml）涂抹（滑动）至载玻片上三次。
22. 通过在室温下加入50μl变性缓冲液（DB）20分钟使细胞DNA变性。
  注意：使用塑料盖玻片来帮助DB展开并避免干燥。
23. 取出塑料盖玻片，用1x PBS清洗含有细胞的载玻片一次。＆nbsp;
24. 通过在室温下加入50μl中和缓冲液（NB）10分钟来中和反应。
  注意：使用塑料盖玻片来帮助NB展开。
25. 取下塑料盖玻片，用1x PBS洗涤含有细胞的载玻片三次。＆nbsp;
26. 在封闭溶液（BS）中稀释一抗[即，大鼠α-CldU单克隆抗体（Accurate）和小鼠α-IdU单克隆抗体（BD）] 1：300。
27. 在含有细胞的载玻片表面上展开50μl稀释的一抗（来自步骤A25）。在室温下孵育2小时。
  注意：使用塑料盖玻片来帮助一抗分散并避免干涸。＆nbsp;
28. 取下塑料盖玻片，用1x PBS洗涤含有细胞的载玻片三次。
29. 在BS中稀释二抗[即，Alexa Fluor 568-缀合的山羊α-小鼠（Thermo Scientific）和Alexa Fluor 488-缀合的山羊α-大鼠（Thermo Scientific）] 1：300。
  注意：从此步骤开始，请勿将幻灯片曝光。
30. 在含有载玻片的细胞上铺展50μl稀释的二抗（来自步骤A28）。在室温下孵育2小时。
  注意：使用塑料盖玻片来帮助一抗扩散并避免干涸。
31. 取下塑料盖玻片，用1x PBS洗涤含有细胞的载玻片三次。
32. 确保从含有细胞的载玻片表面除去所有液体，并加入4μl含有DAPI的Vectashield封固剂。
  注意：此解决方案用作抗褪色安装解决方案，用于染色含有DNA的细胞器。
33. 添加玻璃盖玻片并使用无色指甲油密封。等待清漆干燥5分钟。可以在荧光显微镜下立即分析载玻片，或者在4℃下储存至一个月。图2显示了一个包含该协议部分主要步骤的方案。
  
  图2.表示应用CL Brener和Y菌株（epimastigote形式）方案的主要步骤的示意图。卤化胸苷类似物（CldU和IdU）在每种培养物中分别添加12 H。之后，必须用新鲜培养基洗涤寄生虫，混合并孵育24小时。然后必须洗涤，固定样品并将其添加到载玻片上。接下来，寄生虫细胞必须使其DNA变性，然后使用一抗（α-CldU和α-IdU）和相应的二抗（Alexa Fluor488α-大鼠和Alexa Fluor 568）进行处理以检测胸苷类似物。 α-小鼠）。最后，必须添加带有DAPI的封固介质并将载玻片密封。＆nbsp;
对照（检查抗体的特异性）
1. 准备一套新的 T。 cruzi 文化。如果您使用两个菌株进行先前的分析，请选择一个菌株。孵育 T. cruzi 细胞（28℃）直至它们在10ml培养物中达到指数期（~1×10 7 细胞/ ml）。寄生虫密度根据使用的谱系而变化。
  注意：在我们检测抗体特异性的分析中，我们只使用了 T. cruzi Y在epimastigote形式中的应变。
2. 完全按照前面所述的步骤A2-A5进行操作。
3. 将1x PBS冷却至4°C。
  注意：不要像以前那样混合两种文化。
4. 孵育一段时间后，通过在800 x g 离心5分钟，分别收获掺入CldU和IdU的细胞。
  4℃，用5ml冷的1x PBS洗涤每个样品两次。
5. 小心地从每个样品中取出1x PBS，并将每个沉淀悬浮在1ml冷FB中。转移至1.5 ml微量离心管中。
6. 将每个沉淀在4℃孵育7分钟，并使用5ml冷的1x PBS洗涤它们三次（在每次洗涤中以800μL离心5分钟离心）。对于最后一次洗涤，将每个沉淀小心地悬浮在500μl的1x PBS中。如果它们中的任何一个太小（即，肉眼几乎看不见），将体积减少到100μl的1x PBS。
7. 准备四个载玻片以接收掺入CldU的细胞，并制备四个用于接收IdU掺入的细胞（总计八个载玻片）。在每个载玻片中涂抹2.5μlPLS并让PLS变干。注意：使用盖玻片有助于将PLS扩散到载玻片上。
8. 在载玻片中小心地从每个样品（即，CldU-和IdU-掺入的细胞）（来自步骤B7）扩散悬浮的沉淀物（每个胸苷类似物组的四个载玻片）。使用25μl并保存剩余的悬浮颗粒体积，以备您需要重新制作某些幻灯片时使用。
  注意：使用PLS之前传播的相同表面。
9. 等待细胞在载玻片上在室温下沉降10-15分钟。确保细胞不会变干。
10. 通过在室温下加入50μlPS10分钟使细胞透化。
11. 使用1x PBS洗涤含有细胞的每个载玻片三次。
  注意：使用P1000微量移液管将1x PBS（1 ml）涂抹（滑动）至载玻片上三次。
12. 通过在室温下加入50μlDB20分钟使细胞DNA变性。
  注意：使用塑料盖玻片来帮助DB展开并避免干燥。
13. 取下塑料盖玻片，用1x PBS洗涤含有细胞的每个载玻片一次。＆nbsp;
14. 通过在室温下加入50μlNB10分钟来中和反应。
  注意：使用塑料盖玻片。
15. 取下塑料盖玻片，用1x PBS洗涤含有细胞的每个载玻片三次。＆nbsp;
16. 使用两个分开的微管分别稀释一抗[即，大鼠α-CldU单克隆抗体（Accurate）和小鼠α-IdU单克隆抗体（BD）]。在BS中以1：300稀释每一个。
17. 在含有掺入CldU的细胞（来自步骤B15）的两个载玻片的表面上和在含有掺入IdU的细胞的两个载玻片（来自步骤B15）的表面上展开50μl稀释的一抗大鼠α-CldU。使用另一种稀释的一抗即，小鼠α-IdU，对剩余的四个载玻片重复相同的步骤。在室温下孵育2小时。
  注意：使用塑料盖玻片来帮助一抗分散并避免干涸。＆nbsp;
18. 取下塑料盖玻片，用1x PBS洗涤含有细胞的载玻片三次。
19. 使用两个分开的微管分别稀释二抗[即，Alexa Fluor 568-缀合的α-小鼠（Thermo Scientific）和Alexa Fluor 488-缀合的α-大鼠（Thermo Scientific）]。在BS中以1：300稀释每一个。
  注意：从此步骤开始，请勿将幻灯片曝光。
20. 在含有细胞的下列载玻片（来自步骤B19）的表面上展开50μl稀释的二抗Alexa Fluor488α-大鼠：掺入CldU的+一抗大鼠α-CldU，掺入CldU的+一抗小鼠α- IdU，IdU掺入的+一抗大鼠α-CldU，和掺入IdU的+一抗小鼠α-IdU。使用其他稀释的二抗Alexa Fluor568α-小鼠， ie ，CldU掺入的+一抗大鼠α-CldU，CldU掺入对剩余的四个载玻片（来自步骤B19）重复相同的程序。 +一抗小鼠α-IdU，掺入IdU的+一抗大鼠α-CldU，和掺入IdU的一抗小鼠α-IdU。在室温下孵育2小时。
  注意：使用塑料盖玻片来帮助二抗扩散并避免干涸。＆nbsp;
21. 取下塑料盖玻片，用1x PBS清洗每个载玻片三次。
22. 确保从每个液体中取出所有液体并加入4μl含有DAPI的Vectashield封固剂。
  注意：此解决方案用作抗褪色安装解决方案，用于染色含有DNA的细胞器。
23. 添加玻璃盖玻片并使用无色指甲油密封每个载玻片。等待清漆干燥5分钟。可以在荧光显微镜下立即分析载玻片，或者在4℃下储存至一个月。图3显示了包含该控制协议主要步骤的方案。
  
  图3.表示抗体特异性控制的主要步骤的示意图。该对照测定可应用于两种先前菌株中的任何一种（，，CL Brener和Y）。在每种培养物中分别加入卤化胸苷类似物（CldU和IdU）12小时。之后，每个寄生虫组（掺入CldU和掺入IdU）必须用1x PBS洗涤，固定，并将等分试样分配到四个载玻片上（对于两组总共八个载玻片）。接下来，每个载有寄生虫细胞的载玻片必须使其DNA变性，然后根据规格使用一抗和二抗进行处理以检测胸苷类似物（在方案中，参见载玻片底部的规格）（详情见前面的步骤B21）。最后，必须在每个载玻片中加入含有DAPI的封固剂，然后密封。

数据分析

在荧光显微镜下分析每个载玻片（参见设备的规格）。使用差分干涉对比度（DIC）（如果可用）或相位对比度捕获图像。此外，在对应于荧光发射蓝（DAPI），绿色（CldU）和红色（IdU）的字段中捕获图像。使用相同的曝光时间捕获图像，尤其是CldU和IdU字段。
注意：＆nbsp;
1. 在我们的分析中，我们使用了物镜100x。此外，用于捕获图像的曝光时间可根据所用的显微镜，滤光片和软件而变化。在我们的例子中，使用200-800毫秒的曝光时间捕获图像。
2. 确保至少100个 T。每个实验捕获cruzi 细胞。 DNA交换分析的每张幻灯片（程序A）是一个技术复制品。该协议必须通过独立实验以生物学一式三份制备。
3. 为避免偏见，应采用双盲方法，特别是对于使用两种不同菌株的配对分析。＆nbsp;
4. 在我们的分析中，我们使用了Olympus Cell F软件（版本5.1.2640）。
合并使用ImageJ软件（或允许此方法的其他软件）捕获的图像。图4和图5分别显示了含有细胞的代表性图像：分析的每个菌株中捕获的DNA交换（即，CL Brener和Y），以及抗体特异性控制。

图4.在CL Brener和Y菌株中应用的ADExTA。代表性图像分为六列：DIC（观察细胞形态），DAPI（含有DNA的染色细胞器），掺入CldU的细胞（绿色），掺入IdU的细胞（红色），合并1（CldU） + IdU覆盖），并合并2（DAPI + CldU + IdU覆盖）。白色箭头表示进行DNA交换的细胞，即，它们具有包含CldU和IdU的细胞核。比例尺=10μm。

图5.抗体特异性控制。 CL Brener菌株的代表性图像显示胸苷类似物的识别是特异性的。将CldU-和IdU-掺入的epimastigotes添加到载玻片上并使用小鼠α-IdU + Alexa Fluor 568（小鼠），小鼠α-IdU + Alexa Fluor 488（大鼠），大鼠α-CldU + Alexa Fluor 568（小鼠）进行处理以进行检测。）和大鼠α-CldU + Alexa Fluor 488（大鼠）。我们可以观察到在分析的每个荧光通道（蓝色，红色和绿色）中初级和二级抗体之间完全没有交叉反应。随机拍摄图像。该图改编自Alves et al。（2018）。比例尺=10μm。
计算总细胞数，细胞CldU标记的（绿色），细胞IdU标记的（红色），细胞CldU + IdU标记的（合并时为黄色）和未标记的细胞（蓝色-DAPI）。
注意：总细胞数必须高于100，才能获得可靠的结果。
使用Excel软件（Microsoft Office）建立一个表（或图形），其中包含CldU和IdU标记的细胞百分比，以及双标细胞（ ie ，CldU + IdU标记的）。
注意：可以使用其他软件代替Excel，例如GraphPad Prism（GraphPad软件）。
如果您正在比较两种不同菌株（例如，CL Brener和Y菌株）之间的DNA交换，请使用Student's t -test进行统计分析（双尾，未配对t） - 使用Welch的校正测试）来建立 P - 值。应用此测试，您将发现观察到的差异是否具有统计显着性。图6显示了对于CL Brener和Y菌株估计的DNA交换百分比（黄色柱）以及 P 值的图表。

图6.显示DNA交换测量的条形图。条形图表示分析的两个菌株（Cl Brener和Y）的CldU标记（绿色），IdU标记（红色）和CldU + IdU标记（黄色）细胞的百分比，其代表DNA交换。。每个生物学重复分析超过200个细胞的每个菌株。误差棒表示一式三份的SD。 P - 值是使用学生的 t - 测试获得的。该图中的数值分析最初发表在Alves et al。（2018）。

笔记

一般说明
1. 该方案应在三个独立实验中以生物学一式三份进行。每个实验产生三个技术重复（三个幻灯片）。
2. 虽然大多数销售卤化胸苷类似物（BrdU，CldU或IdU）的公司推荐使用2 M HCl的DNA变性步骤进行检测（例如，Abcam，Sigma-Aldrich），但我们决定使用2.5 M HCl增加含有掺入的胸苷类似物的位点数。这种方法提高了检测效率，但损害了DAPI染色，最近的一项研究证明了这一点（da Silva et al。，2017a）。
技术提示
1. 胸苷类似物的孵育时间根据倍增时间而变化，并且可以针对其他细胞类型进行优化。这对于细胞混合后的孵育时间也是有效的。
2. 从需要二抗孵育的步骤开始，在黑暗中执行此协议。
3. 为避免误报，请勿在捕获步骤中过度曝光荧光图像。

食谱

碱化水
通过将Milli-Q水的pH调节至9.5（使用5米NaOH，借助pH计）制备碱化水
磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
2mM KH 2 PO 4
1. 通过添加8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na 2 HPO 4 和0.24g KH 2 来制备缓冲液。 PO <子> 4
2. 加入800毫升水，用HCl调节pH至7.4
3. 将音量调至1升
4. 将溶液分配成等分试样（例如，250ml）并通过高压灭菌（20分钟，120℃，液体循环）灭菌
5. 在室温下储存长达六个月
6. 长时间使用后检查pH值
肝脏输注胰蛋白酶（LIT）培养基
68 mM NaCl
5.3 mM KCl
56mM Na 2 HPO 4
0.2％（w / v）葡萄糖
0.5％（w / v）肝脏输液肉汤
0.5％（w / v）胰蛋白胨 10毫克/升氯化血红素
10％（v / v）胎牛血清
133 mg / L硫酸链霉素盐
59 mg / L青霉素G钠盐
1. 通过加入4g NaCl，0.4g KCl，8g Na 2 HPO 4 ，5g胰蛋白胨，5g肝脏输注肉汤制备培养基
2. 加入800毫升水，调节pH至7.3（使用5米NaOH，借助pH计），将体积调至880毫升，并通过高压灭菌消毒（20分钟，120℃，液体循环）
3. 使用前，加入1 ml氯化血红素溶液（10 mg / ml，在0.1 M三乙醇胺中），100 ml胎牛血清，20 ml 20％（w / v）葡萄糖，133 mg硫酸链霉素和59 mg青霉素
4. 通过过滤再次灭菌（使用0.22μm过滤器）
5. 在-20°C下储存长达六个月
5'-氯-2'-脱氧尿苷溶液（CldU-S）
在水中稀释的10 mM CldU
1. 通过在9ml水中加入26.26mg 5'-氯-2'-脱氧尿苷制备缓冲液
2. 溶解并完成10毫升的体积
3. 通过过滤（使用0.22μm注射器过滤器）灭菌并将溶液分配成等分试样（例如，1ml）＆nbsp;
4. 在-20°C下储存长达六个月
5'-碘-2'-脱氧尿苷溶液（IdU-S）
将10mM的IdU稀释于水中碱化注意：IdU在生理pH下不易溶解。
1. 通过在5ml碱化的Milli-Q水中加入35.4mg 5'-碘-2'-脱氧尿苷制备缓冲液（借助于pH计，使用5M NaOH将Milli-Q水的pH调节至9.5）
2. 用Milli-Q水溶解并完成10 ml的体积
3. 通过过滤（使用0.22μM注射器过滤器）灭菌并将溶液分配成等分试样（例如，1ml）＆nbsp;
4. 在-20°C下储存长达六个月
固定缓冲液（FB）
1x PBS中4％（w / v）多聚甲醛
1. 通过在40ml 1x PBS中加入2.1g多聚甲醛（粉末，95％）制备缓冲液
2. 用1x PBS溶解并完成50ml的体积
3. 在4°C下储存长达一个月
聚L-赖氨酸溶液（PLS）
在水中稀释的0.1％（w / v）聚-L-赖氨酸盐酸盐
1. 通过在9毫升水中加入10毫克聚-L-赖氨酸盐酸盐来制备缓冲液＆nbsp;
2. 溶解并用水将体积加至10ml
3. 通过过滤灭菌（使用0.22μm注射器过滤器）并将溶液分配成等分试样（例如，1 ml）
4. 在4°C下储存长达六个月
透化解决方案（PS）
在1x PBS中稀释的0.1％（v / v）Triton X-100
1. 通过在9,990μl的1x PBS中添加10μlTritonX-100来制备缓冲液
2. 充分混合，过滤灭菌（使用0.22μm注射器过滤器），然后将溶液分配成等分试样（例如，1 ml）
3. 在4°C下储存长达六个月
变性缓冲液（DB）
2.5 M HCl
1. 通过在7.9ml水中加入2.1ml HCl（浓缩37％）制备缓冲液
2. 小心混合，因为这种溶液有刺激性
3. 此解决方案无法存储，必须在使用前立即生成
中和缓冲液（NB）
100 mM硼酸
75 mM NaCl
25 mM四硼酸钠
1. 通过加入620毫克硼酸，440毫克NaCl和950毫克四硼酸钠来制备缓冲液
2. 加入80毫升水，用NaOH调节pH至8.4
3. 将体积减至100 ml并过滤灭菌（使用0.22μm注射器过滤器）
4. 在室温下储存长达六个月
阻塞解决方案（BS）
4％（w / v）牛血清白蛋白在1x PBS中稀释
1. 通过在9ml 1x PBS中加入400mg牛血清白蛋白（粉末，≥98％）制备缓冲液
2. 用1x PBS溶解并完成10ml的体积
3. 通过过滤灭菌（使用0.22μm注射器过滤器）
4. 在4°C下储存长达一个月

致谢

我们要感谢参与制定该议定书的实验室的所有成员。我们还感谢资助机构的支持：圣保罗研究基金会（FAPESP） - 毒素中心，免疫应答和细胞信号传导（CeTICS）（拨款号2013 / 07467-1,2014 / 24170-5,2017 / 18719-2 ），国家科学和技术发展委员会（CNPq）（项目编号：870219 / 1997-9,304329 / 2015-0），米纳斯吉拉斯州研究支持基金会（FAPEMIG），改善高等教育人员协调（CAPES）和Wellcome分子寄生虫学中心。

利益争夺

作者声明，本文的发布不存在任何利益冲突。

参考

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