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可以使用Ensembl Genome Browser（ www.ensembl.org ）和UCSC基因组浏览器鉴定基因组和个体基因（ https://genome.ucsc.edu ）。对于这项研究，使用基因组装配JGI 4.2检查青蛙的 Igf1 基因，热带非洲爪蟾，以及 IGF1 基因。黑猩猩， Pan troglodytes ，使用基因组装配Pan_tro_3.0。 RNA测序信息摘自国家生物技术信息中心的序列阅读档案（SRA NCBI; www .ncbi.nlm.nih.gov / sra ）通过查询具有特定60个核苷酸的DNA片段的以下数据集：热带非洲爪蟾（肝脏; SRR5412275）， Pan troglodytes （肝脏，SRR4444973;肾，SRR1758922;骨骼肌，SRR1758929;和心脏，SRR6706810）。使用megablast选项进行搜索（针对高度相似的序列进行优化;最大目标序列-500（可设置为50至20,000）;期望阈值-10;字大小-11;匹配/不匹配分数-2，-3;缺口成本存在5，扩展2;低复杂度区域过滤;参见： https：// blast .ncbi.nlm.nih.gov / Blast.cgi ;另见图2中的屏幕截图。

程序

具体步骤在下面描述，并在图1和3中概述。图2示出了作为实际工作流程的屏幕截图呈现的主要数据的示例。

图1.基因表征步骤概述

绘制基因的5'和3'末端
1. 从SRA NCBI中确定合适的RNA测序文库（ www.ncbi.nlm.nih.gov/sra );
2. 用一系列约60个核苷酸的相邻基因组DNA序列筛选这些RNA测序文库中的每一个（=探针;可以选择其他长度但是60个核苷酸给出一致的结果）。探针可以设计为重叠5-10个核苷酸，但这不是必需的。从已知外显子内的区域开始，分别以5'或3'方向移动，分别适用于5'或3'端映射（参见图3B和3C）。＆nbsp;
3. 计算每个探针的匹配序列数。继续搜索，直到匹配的序列读数低于阈值（例如，少于10-15），至少连续两次探测：
  警告1 ：一些复杂程度较低的DNA序列不匹配任何东西，或者匹配太多不同的区域。低复杂性序列将包含相同核苷酸的长段或两个核苷酸的交替运行。如果发现许多匹配，则该问题的关键在于它们映射到基因组的不同区域而不是一个位置。如果检测到单个基因的转录物，则仅预期后者。
  警告2 ：一些基因不能在常用的组织RNA样本中表达。＆nbsp;
4. 如何知道你何时完成？
  1. 对于5'末端作图，在最后一个探针内匹配的序列应该在彼此的几个核苷酸内结束。理想地，在进一步的5'方向的短距离内，应识别近端启动子元件，例如TATA盒（参见图3B）。＆nbsp;
  2. 对于3'末端作图，在最后一个探针内匹配的序列应在彼此的几个核苷酸内结束。理想地，聚腺苷酸化识别序列应在距离最后表达的核苷酸5'的短距离处发现（参见图3C）。
    
    图2.主要工作流程的屏幕截图示例。 A. SRA NCBI RNA测序文库SRX501262的Blast搜索的屏幕截图。显示了探针的DNA序列，以及正在搜索的RNA测序实验，以及搜索的各种其他参数。请注意，已选择高度相似序列的megablast选项。 B.来自该实验的输出的屏幕截图，以总共395个匹配的图形形式说明前100个测序命中。在该图的底部是两个匹配的描述，可以选择这两个匹配以查看DNA序列的实际比对。
如何量化替代mRNA剪接
1. 从SRA NCBI中确定合适的RNA测序文库（ www.ncbi.nlm.nih.gov/sra ).
2. 构建两个~60个核苷酸的探针：
  第一 in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in in and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and从第一个外显子开始的第一个~30个核苷酸，可以是可选择的剪接。第二 in silico 探针应包含最后一个共同外显子3'末端的最后30个核苷酸，从第二个外显子开始的第一个~30个核苷酸，可以是可选地剪接。如果可能的替代RNA剪接模式更复杂，可以使用类似策略生成更多探针。＆nbsp;
3. 用这些杂合双外显子探针筛选相同的RNA测序文库。＆nbsp;
4. 计算每个探针的匹配序列的数量，仅包括与每个可选剪接mRNA中彼此相邻的两个外显子中的区域相同的那些（参见图3D）。
  
  图3.使用来自RNA测序文库的数据进行基因作图的示意图。：一种。在Ensembl和UCSC基因组数据库中找到您最喜欢的基因（ Yfg ）的图谱。该基因含有四个外显子，并且似乎分别在外显子1和4中缺乏鉴定的5'或3'UTR。在基因图谱下方预测 Yfg 转录物和表征的 Yfg 蛋白质显示出替代RNA剪接是两种不同蛋白质同种型的原因。 B.全长 Yfg 外显子1的图，其使用来自SRA NCBI中发现的RNA测序文库的基因表达数据通过使用60-bp基因组区段ag作为探针筛选文库来作图。。图下方的DNA序列说明了外显子1的推定的5'末端，箭头指示了最长的RNA测序克隆的位置。可能的TATA框带有下划线。 C.使用如图所示的探针a-g，使用B中所示的方法绘制的全长 Yfg 外显子4的图。图下方的DNA序列显示了 Yfg 外显子4的推定的3'末端。潜在的多腺苷酸化信号加下划线并且垂直箭头描绘了 Yfg 转录本的可能的3'末端。，它被确定为最长的RNA测序克隆的位置。 D.通过筛选来自不同组织的RNA测序文库，定义 Yfg 基因表达中的备选RNA剪接，使用来自外显子1和3的3-30-bp探针（来自外显子1的3'30-bp）到外显子3的5'30-bp或外显子1和3（外显子1的3'30-bp与外显子3的5'30-bp融合）。 E.基于B-D中所示的分析， Yfg 的结构。＆nbsp;

数据分析

使用RNA测序文件作为主要数据源的基因作图方法的概述如图3所示，并在图1中示意图。具有4个外显子的可能的蛋白质编码基因（ Yfg ）具有通过外显子调用算法从基因组装配定义。显示在基因组数据库中的基因缺乏5'和3'UTR，这与正常的真核基因结构（Cazzola和Skoda，2000; Kozak，2000）形成对比，因此是不完整的（图3A）。假定的mRNA同样是不完整的，因为它们也缺乏UTR，尽管至少有两种从该基因预测的蛋白质在Uniprot中被“发现”（真实数据见： http://www.uniprot.org/ ），该基因确实可能经历了替代RNA处理以产生编码每种蛋白质的不同转录物（图3A）。
＆NBSP;对于想要详细研究该基因的研究者而言，最初的实验问题是完全定义它。例如，如果实验重点是转录调控，作为先决条件，需要鉴定和表征启动子或启动子。因此，5'UTR将需要完整地映射，并且需要定义转录起始位点（图3B）。然后启动子应该与起始位点相邻。类似地，如果实验目标是研究控制RNA稳定性的机制，则需要定义基因的5'和3'末端。这也需要映射完整的3'UTR（图3C）。类似地，如果研究者有兴趣分析替代RNA剪接的机制或不同mRNA同种型的可翻译性，则需要表征各种mRNA种类（图3D）。

绘制基因的5'和3'末端
作为5'和3'UTR作图的指导性实例，非洲爪蟾Igf1 基因选自Ensembl和UCSC基因组浏览器。该基因显然由四个编码外显子组成，但在外显子1中以ATG翻译起始密码子开始，在外显子4中以TAA终止密码子结束（图4A），这显然是不完整和不正确的（Cazzola和Skoda，2000; Kozak，2000; Rotwein，2018a）。此外，由于在NCBI核苷酸数据库中没有实验定义的非洲爪蟾Igf1 cDNA（截至2018年11月），因此没有数据可以提供进入5'或3'UTR的数据。幸运的是，非洲爪蟾 RNA测序文库可在SRA NCBI中获得。在这里，选择肝脏库进行作图实验，因为 Igf1 在其他物种的肝脏中高度表达（Rotwein，1986; Hoyt et al。，1988; Adamo et al。，1991; Woelfle et al。，2003）。通过使用在外显子1的编码区内发现的60-bp DNA区段以及在非洲爪蟾Igf1 基因座的该部分中进一步5'进行连续的超级细胞搜索来查询该RNA测序文库（图4B）。基于所获得的结果，假定外显子1的长度似乎为~212bp，并且由63bp的编码DNA和149bp的5'UTR组成（图4B）。一个潜在的TATA盒，有助于在转录开始时定位RNA聚合酶II（Gill et al。，1994; Albright和Tjian，2000），无法在5'到最长的这里绘制了非洲爪蟾Igf1 转录本，尽管这一结果与其他脊椎动物和哺乳动物的 Igf1 基因的已知结果一致，因为启动子不含TATA（Rotwein，2017a和2018b）而且似乎含有引发剂样元件以在转录起始区域定位RNA聚合酶II（Smale和Baltimore，1989; Vo Ngoc 等人，2017）。
＆NBSP;使用相同的肝脏RNA测序文库（图4C），使用类似的策略来表征 Igf1 外显子4（Rotwein，2018a）的全部程度。基于这些结果，非洲爪蟾Igf1 外显子4似乎由3,590bp组成，包括在其3'末端附近的假定poly A识别序列和推定的poly A添加位点11bp进一步3'（表格） et al。，1990; Proudfoot，2011）（图4C）。总之，此处描述的结果暂时定义了非洲爪蟾Igf1 基因的5'和3'末端，并表明该基因跨越~63,691bp（图4D）。现在这些数据可以用作解决基因调控的不同方面的其他实验的起点。

图4. 热带非洲爪蟾Igf1 基因的定位。 A. Ensembl基因组数据库中发现的非洲爪蟾Igf1 基因图谱。外显子显示为黑盒子，内含子和侧翼DNA显示为水平线。基因的长度为58,592个碱基对（bp），显示在3'末端。外显子2和3之间的大内含子被截短，其长度以bp列出。标记ATG和TAA密码子的位置并示出比例尺。没有5'或3'UTR已被确定。 B.使用从RNA测序文库SRX2704323获得的基因表达数据绘制非洲爪蟾Igf1 外显子1的5'末端。用60-bp基因组区段a-f筛选文库作为探针。图下方的DNA序列显示了外显子1的推定的5'末端，箭头指示了最长的RNA测序克隆的位置。 C.使用来自RNA测序文库，SRX2704323和60-bp基因组区段a-i作为探针的数据表征非洲爪蟾Igf1外显子4的推定的3'末端。可能的多腺苷酸化信号在图下方的DNA序列中加下划线，垂直箭头描绘了 Igf1 转录物的潜在3'末端，如最流行的最长RNA测序克隆所定义。 D.基于B和C中分析结果的非洲爪蟾Igf1 基因的结构。标记与A中一样，外显子1和4的5'和3'UTR分别显示为白色框。弯曲的箭头表示假定的转录起始位点的位置和poly A添加位点的垂直箭头。

量化替代RNA剪接
人 IGF1 基因由6个外显子和5个内含子组成，通过使用两个不同的启动子转录并加工成多个mRNA种类，以及涉及外显子4,5和6的替代RNA剪接（Rotwein， 2012年和2017年a）。黑猩猩 IGF1 的DNA序列与人类基因的同源性约为99％（Rotwein，2017b），基于这种紧密的同源性，预计会经历类似的替代RNA加工模式（图5A），但没有实验数据来支持或反驳这个想法。因此，来自肝脏，肾脏，骨骼肌和心脏的黑猩猩RNA测序文库用三种不同的60-bp的DNA探针进行查询：一种由3'30 bp的外显子4和5'30 bp组成。外显子5;另一个包含3'30 bp的外显子4与外显子6的5'30 bp融合，第三个包含30 bp的外显子5片段，位于预测的供体位点的5'处，用于RNA剪接（5' - AAGGAAAGgtgggcca-3'），与外显子6的5'30 bp连接（图5B）。使用这些探针的查询显示所有三种可能类型的mRNA在所研究的四种组织中表达，但是具有不同的转录物水平（图5C）。肝脏和肾脏中的稳态 IGF1 基因表达分别比骨骼肌或心脏高5至20倍。此外，在所有四种器官和组织中，含有外显子4,5和6的mRNA是最丰富的，并且编码外显子4和5的转录物最少（图5C）。总的来说，这些观察结果证明了一种直接和直接的方法来量化单个基因表达的不同方面。

图5.为 Pan troglodytes IGF1 基因定义备选RNA剪接。 A. Pan troglodytes IGF1 基因的最后三个外显子的示意图，外显子显示为盒子（编码区域为黑色或灰色，非编码区域为白色），内含子和侧翼DNA为水平线。显示了TGA和TAG密码子的位置，并且标尺为说明。导致不同的 Pan troglodytes IGF1 mRNA的RNA剪接模式描绘在基因下方。它们由外显子4,5和6的不同组合产生（小虚线 - 外显子4和5;大虚线 - 外显子4和6;实线 - 外显子4,5和6）。 B. Pan troglodytes IGF1 mRNA的图，说明用于量化备选RNA剪接的探针的位置。 C.使用来自外显子4和5,4和6，以及5和6的60-bp片段探测成人肝脏，肾脏，骨骼肌和心脏中的 Pan troglodytes IGF1 基因表达的比较RNA测序文库SRR4444973，SRR1758922，SRR1758929和SRR6706810分别使用图1D中概述的模式。

摘要
这里描述的实验方案和具体实例证明了稳健，易于使用和适应性强的方法，从基因组数据库中可用的有限数据集开始，验证和扩展关于未完全表征的个体基因的信息。这些程序不仅可以有效替代基于实验室的分子生物学方法，而且可以快速解决主要的基因定位问题，同时为后续实验确定新的方向。

笔记

这些方法的再现性非常高。在使用相同的RNA测序文库和相同的60-bp探针进行重复筛选时，获得了相同的结果。＆nbsp;
技术提示：将“最大目标序列”设置得足够高，以捕获基因表达的全部范围（即，以识别所有数据）。但是，数字越大（范围为50到20,000），搜索的时间就越长。＆nbsp;
其他可能的用途：这种方法可用于任何RNA，以量化其表达水平或识别替代转录物。
警告：这种方法对单个基因很有用，但不是用于同时研究全球替代RNA剪接或同时分析许多基因的5'或3'末端的途径。

致谢

这些研究部分得到美国国立卫生研究院研究基金R01 DK042748-28（致P. R.）的支持。

利益争夺

作者没有竞争性的财务或其他利益来申报。

参考

Adamo，M。L.，Ben-Hur，H.，Roberts，C。T.，Jr。和LeRoith，D。（1991）。通过大鼠胰岛素样生长因子-I基因的前导外显子调节起始位点的使用方法发育，禁食和糖尿病。 Mol Endocrinol 5（11）：1677-1686。＆nbsp;
Albright，S。R.和Tjian，R。（2000）。重新审视TAF：更多数据显示新曲目并确认旧观点。 Gene 242（1-2）：1-13。＆nbsp;
Cazzola，M。和Skoda，R。C.（2000）。转化病理生理学：一种新的人类疾病分子机制。 Blood 95（11）：3280-3288。
Frohman，M。A.，Dush，M。K.和Martin，G。R.（1988）。从稀有转录本中快速生成全长cDNA：使用单一基因特异性寡核苷酸引物进行扩增。 Proc Natl Acad Sci USA 85（23）：8998-9002。
吉尔，G。（1994）。转录启动。采取主动。 Curr Biol 4（4）：374-376。＆nbsp;
Hoyt，E.C.，Van Wyk，J.J。和Lund，P.K。（1988）。大鼠胰岛素样生长因子I信使核糖核酸复杂家族的组织和发育特异性调节。 Mol Endocrinol 2（11）：1077-1086。＆nbsp;
Kozak，M。（2000）。人类cDNA的5'非翻译域是否会对启动翻译的规则提出质疑（或者是副词反之亦然。基因组学 70（3）：396-406。
Proudfoot，N。J.（2011）。结束消息：poly（A）信号然后现在。 Genes开发 25（17）：1770-1782。＆nbsp;
Rotwein，P。（1986）。两种胰岛素样生长因子I信使RNA在人肝脏中表达。 Proc Natl Acad Sci USA 83（1）：77-81。＆nbsp;
Rotwein，P。（2012）。绘制生长激素 - Stat5b - IGF-I转录电路。趋势内分泌代谢 23（4）：186-193。＆nbsp;
Rotwein，P。（2017a）。哺乳动物中胰岛素样生长因子1基因的多样化。 PLoS一个 12（12）：e0189642。
Rotwein，P。（2017b）。灵长类动物中胰岛素样生长因子1基因的变异。内分泌学 158（4）：804-814。＆nbsp;
Rotwein，P。（2018a）。胰岛素样生长因子2基因和非哺乳动物脊椎动物的基因座：组织简单，重复但有限的鱼类分歧。 J Biol Chem 。 doi：10.1074 / jbc.RA118.004861。
Rotwein，P。（2018b）。脊椎动物中胰岛素样生长因子1基因的变异。内分泌学 159（6）：2288-2305。
Sheets，M.D.，Ogg，S.C。和Wickens，M.P。（1990）。 AAUAAA中的点突变和poly（A）添加位点：对卵裂的准确性和效率的影响和多聚腺苷酸化体外。 Nucleic Acids Res 18（19）：5799-5805。＆nbsp;
Smale，S。T.和Baltimore，D。（1989）。 “发起人”作为转录控制元素。 Cell > 57（1）：103-113。
Vo Ngoc，L.，Wang，Y。L.，Kassavetis，G。A.和Kadonaga，J。T.（2017）。严谨的RNA聚合酶II核心启动子。 Genes Dev 31（13）：1289-1301。＆nbsp;
Woelfle，J.，Billiard，J。和Rotwein，P。（2003）。通过Stat5b对生长激素对胰岛素样生长因子-I基因的转录进行急性控制。 J Biol Chem 278（25）：22696-22702。
Zinn，K.，DiMaio，D。和Maniatis，T。（1983）。鉴定与人类β-干扰素基因相邻的两个不同的调控区域。 Cell 34（3）：865-879。