材料和试剂

注意：我们为实验室试剂（如吸头，试管和化学品）指出了我们的供应商和产品编号，但是，任何供应商都可能是合适且充足的。

0.2-20μl移液器吸头（VWR，目录号：89079-438）
显微镜载玻片，1“x 3”x 0.4“（Surgipath-Leica，目录号：3800240）
培养皿，任何带通风肋的60 x 15 mm板（Kord-Valmark，目录号：2901）
玻璃底盘：35毫米盘，14毫米玻璃微孔（1.5号盖玻片，MatTek，目录号：P35G-0.170-14-C）
Parafilm，4“x 125'（Parafilm M，目录号：PM996）
巴斯德吸管，5¾“火石玻璃（Fisher Scientific，目录号：50-930-565）＆nbsp;
通用实验室标签胶带，¾“（VWR，目录号：89098-004）
12毫米管（任何类型的直径12毫米的管都可以使用; VWR，目录号：20170-579）
通过使用火焰将铂丝连接到巴斯德吸管上手工制作的蠕虫镐
0.1-μm聚苯乙烯珠（Polybead，Polysciences，目录号：00876，储存于4°C）＆nbsp;
解剖刀片（不锈钢手术刀片，4-311）
Escherichia coli OP50（来自Caenorhabditis遗传中心）
琼脂糖（任何通常用于凝胶电泳的琼脂糖品牌，例如，VWR，目录号：9012-36-6）
浸油，100x / 1.4 NA（Leica Microsystems，目录号：11513859）
氯化钠（NaCl）（RPI，目录号：7647-14-5）
蛋白胨（RPI，目录号：73049-73-7）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：57-88-5）
氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：10035-04-8）
硫酸镁（MgSO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：7487-88-9）
琼脂（RPI，目录号：9002-18-0）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（RPI，目录号：7778-77-0）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：7558-80-7）
乙醇
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（见食谱）
M9缓冲区（见食谱）
10％琼脂糖垫（见食谱）

设备

适用于带有Andor MicroPoint 365 nm脉冲激光（Leica，型号：Leica DMi8）的实时成像（如Leica DMi8）的显微镜
湿度室（湿纸巾盒和高架表面）＆nbsp;
微波炉（任何品牌应该工作，我们使用松下变频器，型号：NN-S543BFR）
立体显微镜（徕卡显微系统，型号：KL200 LED）
20°C培养箱（Nor-Lake Scientific冷藏培养箱，LRI201WWW / 0）
37°C培养箱（Precision Scientific Thelco Incubator，型号：31483）
高压灭菌器
4°C冰箱

软件

MetaMorph软件（Molecular Devices，LLC，版本7.8.12.0）
斐济（斐济只是ImageJ）（可在 imagej.net/Fiji 免费下载）（Schindelin et al 。，2012）
GraphPad Prism v6（GraphPad软件，La Jolla California USA， www.graphpad.com/ ）

程序

蠕虫准备
蠕虫饲养教学可以在WormBook中找到（Stiernagle，2006）。
1. 将10毫升NGM琼脂培养基（参见食谱）倒入60 x 15毫米培养皿中，并在接种 E前放置2天。大肠杆菌 OP50。
2. 从新鲜的起子中加入OP50，在37°C下孵育过夜。文化 C.线虫菌株用于这些平板上的活体成像实验并保持在20℃。
3. 在计划的实时成像实验前一天选择所需菌株的L4阶段蠕虫，使蠕虫成为实验的一日龄成虫。我们使用挑选移动蠕虫并根据外阴的形状识别L4阶段。然而，可以使用其他方法，例如漂白同步（Porta-de-la-Riva et al。，2012）。
实时成像样品制备
有关以下3个步骤的直观表示，请参见图1.
1. 将6μlM9缓冲液置于玻璃底皿的中心以制备实时成像样品。选择所需数量的蠕虫并放入M9滴中，注意尽可能少地转移细菌。
  注意：由于我们可以在Leica DMi8上保存的阶段数量有限，我们通常会在M9缓冲区中放置最多5个蠕虫。＆nbsp;
2. 轻轻移除尽可能多的M9缓冲液，不要使蠕虫干燥，并注意不要将蠕虫吸入移液器吸头。＆nbsp;
3. 将0.75μl聚苯乙烯珠粒从原料中放入蠕虫中。轻轻地将10％琼脂糖垫的小圆形切口放在蜗杆上，注意不要在过程中拖动蠕虫，这将覆盖大部分暴露的盖玻片。我们使用12毫米管切割这些圆圈。 10％琼脂糖垫制备详见配方3。
  注意：此步骤最好快速完成，以避免蠕虫干燥。我们使用解剖刀片抬起并放置琼脂糖垫。
4. 在解剖显微镜下观察蠕虫。一旦蠕虫停止在垫子下面移动（通常约3分钟），将盖子放在玻璃底盘的顶部，并将盖子塞在培养皿上（这可以防止琼脂糖垫和蠕虫干燥）。在封口膜上画一个垂直标记，作为在显微镜上设置坐标的参考（图2）。
图1.实时成像样品制备。步骤B部分的步骤B1-B3，说明在将封口膜应用于玻璃底皿之前进行适当的实时成像准备的步骤。步骤B1-B3参考图像说明过程中的特定步骤。＆nbsp;

图2.玻璃底盘设置。 A.玻璃底盘准备好成像。 B.显微镜上的玻璃底盘。
MetaMorph成像设置和参数
1. 成像应在保持恒温20-23°C且在黑暗中的房间内进行。＆nbsp;
2. 打开Leica倒置显微镜以及Andor MicroPoint软件。在打开MetaMorph软件之前，请确保示波器已完全打开。＆nbsp;
3. 将玻璃底盘放在示波器上，并将封尾膜上的垂直参考标记对准示波器平台上的某个位置，以便在客观变化后保存的任何XY坐标都相同（图2B）。使用20x物镜定位蠕虫并将其XY坐标保存在Leica倒置显微镜上。在更换物镜之前取下玻璃底盘。
4. 将物镜设置为100x并将一小滴100x / 1.4 NA浸油直接放在物镜上。确保MetaMorph工具栏中的放大率设置为100x。否则微辐射技术将无法运作。这将自动提高目标。在更换平台上的玻璃底盘之前将其降低。＆nbsp;
5. 将玻璃底盘放回示波器平台，使用封口膜上的垂直参考标记将玻璃底盘准确定位在之前的位置，确保所保存的XY坐标对于所有蠕虫都是相同的。
6. 在MetaMorph中，打开应用程序＆gt;多维采集（MDA）。这将打开一个窗口，允许您设置延时成像的参数（图3）。＆nbsp;
7. 在“波长”选项卡下，指定实验的波长数（例如，2个波长，一个用于明场（BF），一个用于GFP）。每个波长的相应标签将打开，并在每个波长下指定曝光时间。 BF使用20 ms，GFP使用500 ms。选中“Z波长系列”复选框，确保为实验设置的Z系列一直在特定波长的设定范围内采集（图3C）。
8. 将光源强度设为5％。＆nbsp;
9. 要在MetaMorph程序中可视化计算机上的蠕虫，请使用小型摄像头和播放图标点击按钮（图3E）。这将从显微镜中提取实时信号，然后您可以使用它来设置适当的阶段。
10. 在MDA窗口的“阶段”选项卡下，将蠕虫区域的阶段或位置设置为在X，Y和Z平面中定位。可以保存这些阶段以便进行调整，这些阶段将是在采集期间自动移动和成像的阶段（图3B）。＆nbsp;
11. 在“Z系列”选项卡下，指定在设置阶段时指定的中心Z平面周围要获取的步数（在我们的示例中为核的中间）。通过Z平面的步数和每个步长的大小可以在此选项卡下设置（图3D）。
12. 在“Timelapse”选项卡下设置实验的时间间隔和持续时间/时间点数（例如，每2分钟一次，持续60分钟;图3A）。请务必考虑您在每个阶段获得的阶段数和获取的Z平面数，并在每个阶段获取之间留出足够的时间来获取每个阶段。每一步都要经过飞机需要时间，如果选择了多个波长则需要更长的时间。＆nbsp;
13. 在MDA窗口的“保存”选项卡中指定程序输出的保存位置。
  
  图3.多维采集。电影获取的主要配置（左侧）的屏幕截图，其中扩展了相应的选项卡（右侧）。
微辐射
1. 在MetaMorph中，打开设备＆gt; MicroPoint目标照明。这用于细胞核的微辐射，并可根据所需的DNA损伤类型设置为各种衰减（例如，Koury 等。 [2018]使用15％然而，尽管减少了数量，但是可以观察到微辐射诱导的病灶，其低至5％。
2. 对于Koury 等人（2018），设置了以下参数：
  1. “配置”选项卡（图4A）
    1. 照明设置（脉冲期间）：微点
    2. 坐标系设置（必需）：100x
    3. 校准期间显示图像（选中复选框）
    4. 校准点范围（最大范围的百分比）：40％
    5. 脉冲数：1
    6. 衰减板：传输率的15％
  2. “位置”标签（图4B）
    1. 坐标系设置：100x
    2. 目标位置：所有地区
    3. 将目标位置转移到获取的图像（选中框）
  3. “游戏中时光倒流”标签
    1. 分数：6
    2. 间隔：1
    3. 单位：微秒
    4. 获取堆叠当前设置
3. 在MDA窗口中，一旦设置了所有需要的参数，点击“获取”（图3G）。
4. 记录第一个时间点后，立即暂停程序。访问每个保存的阶段，拍摄快照（工具栏中的摄像头图标），然后使用工具栏中的圆圈选择工具来定位选定的细胞核。在每个阶段的核选择之后命中脉冲（“位置”选项卡，图4B）。选择每个阶段的原子核和脉冲，然后再继续下一个阶段。恢复时间流逝成像并允许程序在所需的时间范围内运行。
  注意：尽快执行此步骤，以确保所有阶段大约在同一时间进行微辐射。
  
  图4. MicroPoint目标照明。 MicroPoint Targeted Illumination参数的“配置”（A）和“位置”（B）选项卡的屏幕截图。在这两个窗口中配置微辐射功率的设置和损坏感应的位置。
恢复（可选）
蠕虫只能在玻璃底盘上维持最长2小时。许多实验需要在以后的时间点进行分析或通过其他方法进行分析（例如，解剖用于基于免疫荧光染色的实验）。在这种情况下，您需要恢复蠕虫。
1. 从玻璃底盘中取出封口膜，以在微辐射后恢复蠕虫。将350μlM9放在琼脂糖垫上。＆nbsp;
2. 轻轻抬起打击垫边缘，让M9在下面清洗，然后将打击垫从蜗杆上取下。
  注意：我们使用玻璃底盘准备程序中提到的解剖刀片在此步骤中提起琼脂糖垫。＆nbsp;
3. 使用玻璃巴斯德吸管将蠕虫转移到NGM板，用于任何后续实验。

数据分析

图片导出
1. 在MetaMorph中，打开应用＆gt;回顾多维度获取。在此窗口下突出显示您要查看的荧光通道。可以在此处指定时间点的数量以及要在导出的文件中包含的Z平面。＆nbsp;
2. 选择所需的时间点和Z平面后，点击“Z Projection”选项卡下的“Create Rotation”按钮。在第二个窗口提示中点击“创建”。将选择保存为TIFF，以便在斐济进行进一步分析（文件＆gt;保存）。有关生成的文件，请参见视频1.
  视频1. GFP :: RAD-51在spo-11背景中。 gfp :: rad-51的输出示例; spo-11应变之前（第一帧）和微辐射之后（所有后续帧）。绿色= GFP :: RAD-51。图5显示了同一部电影的样本分析。
统计分析
在Fiji-ImageJ中手动量化病灶后（见图5），进行不成对的非参数检验（我们使用Mann-Whitney检验）。如果在一个实验中进行多次比较，则应执行Kruskal-Wallis检验以确定在进行成对比较之前是否有任何组与其他组显着不同。可以使用GraphPad Prism软件执行统计。

图5.示例数据集。：一种。在从MetaMorph导出数据之后，可以在斐济 - ImageJ中分析上面的图像。数字表示每个细胞核中病灶的出现顺序。有关完整视频，请参见视频1。比例尺=6μm。 B.对于菌株 gfp :: rad-51 spo-11 的所有6个微辐射核中每个焦点的出现时间（以分钟为单位）的定量。颜色对应于在A中测量的核。误差条是平均值±SD（也可以使用SEM）。有关量化数据输出的更多示例，请参阅Koury 等人（2018）。

笔记

设置阶段时，限制蠕虫暴露于GFP通道。如果暴露时间过长，过度暴露会使蠕虫和所需的荧光标记蛋白漂白。尽量保持在明亮的领域。我们通常会看到漂白大约一个半小时进行成像，每2分钟接触一次GFP。＆nbsp;
在同一个玻璃底盘上同时可以同时成像5个蠕虫，间隔为2分钟，但任何超过5个蠕虫，或间隔不到2分钟，都可能导致蠕虫在结束前漂白。期望的时间间隔。对于较短的间隔，您可能需要使用较少的蠕虫。

食谱

注意：有关详细信息，请参阅Stiernagle，（2006）。

线虫生长培养基（NGM）琼脂平板
3克NaCl
2.5克蛋白胨
1毫升5毫克/毫升乙醇中的胆固醇
1毫升1M CaCl 2
1毫升1M MgSO 4
20克琼脂
加入蒸馏的H 2 O至1升
混合并高压灭菌（250°F下50分钟）灭菌
冷却至室温以上，然后加入25 ml 1 M KH 2 PO 4
确保混合物的pH值为6
倒入培养皿并在4°C储存
M9缓冲区
将以下所有成分一起加入1升容器中
3克KH 2 PO 4
6g Na 2 HPO 4
5克NaCl
1毫升1M MgSO 4
加水量最高可达1升
通过高压灭菌（250°F下50分钟）灭菌并在室温下储存
10％琼脂糖垫
20毫升M9缓冲液
2克琼脂糖
1. 将2g琼脂糖搅拌入20ml M9中，得到10％琼脂糖+ M9溶液
2. 微波溶液，每5秒搅拌一次，直至溶液澄清并流动。在用于垫制作之前连续搅拌以避免任何凝固。这也可以防止过多的气泡积聚
3. 在没有胶带的干净显微镜载玻片的两侧放置两个显微镜载玻片，每层带有两层实验室胶带。将一片½“琼脂糖溶液放在透明载玻片上，然后立即用另一个清晰的显微镜载玻片平放到底部载玻片的方向（见图6）
  注意：快速移动以避免冷却琼脂糖溶液。＆nbsp;
4. 存放在湿度箱内以避免干燥
  
  图6.琼脂糖垫的制备。按照配方3详细说明，按压加热的琼脂糖以形成用于实时成像样品制备的琼脂糖垫的图示。

致谢

这项工作由美国国立卫生研究院（NIH）[R01GM112657至S.S.]资助。我们感谢Dylan Cooke批判性地阅读这份手稿。我们感谢Yizhi Yin在协议开发的最初阶段提供的帮助。

利益争夺

作者没有利益冲突或利益冲突。

参考

Aten，J.A.，Stap，J.，Krawczyk，P.M.，van Oven，C.H.，Hoebe，R.A.，Essers，J.and Kanaar，R。（2004）。通过聚集受损染色体结构域揭示DNA双链断裂的动力学。科学 303（5654）：92-95。
Kong，X.，Mohanty，S.K.，Stephens，J.，Heale，J.T。，Gomez-Godinez，V.，Shi，L。Z.，Kim，J。S.，Yokomori，K。和Berns，M。W.（2009）。不同激光系统的比较分析，以研究细胞对哺乳动物细胞DNA损伤的反应。 Nucleic Acids Res 37（9）：e68。
Koury，E.，Harrell，K。和Smolikove，S。（2018）。差异RPA-1和RAD-51招募体内贯穿整个℃。通过激光微辐射揭示的线虫种系。 Nucleic Acids Res 46（2）：748-764.s
Porta-de-la-Riva，M.，Fontrodona，L.，Villanueva，A。和Ceron，J。（2012）。基本 Caenorhabditis elegans 方法：同步和观察。 J Vis Exp （64）：e4019。
Schindelin，J.，Arganda-Carreras，I.，Frize，E.，Kaynig，V.，Longair，M.，Pietzsch，T.，Preibisch，S.，Rueden，C.，Saalfeld，S.，Schmid，B 。，Tinevez，JY，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri，K.，Tomancak，P。和Cardona，A。（2012）。斐济：生物图像分析的开源平台。 Nat方法 9（7）：676-682。
Stiernagle，T。（2006）。 C的维护。线虫。 WormBook ：1-11。