材料和试剂

60 mm培养皿（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：AS4051）
100毫米培养皿（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：FB0875712）
注射器过滤器单元，0.22μm（Millipore Sigma，Millex ® -GV，目录号：SLGV033RS）
磨砂显微镜载玻片25 x 75 x 1.0 mm（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：12-552-3）
微观盖玻片18 x 18 mm（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：12-542A）
℃。线虫野生型：来自 C的N2 Bristol菌株。线虫遗传中心
JR672 wIs54 [P scm :: gfp ] V; wIs54 是接缝细胞特异性转录GFP报告基因的整合等位基因，在所有发育阶段的所有接合细胞中均有表达（Terns et al。，1997; Koh和Rothman，2001）
电子。大肠杆菌OP50-1：来自 C的链霉素抗性菌株。线虫遗传中心
左旋咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：L9756）
NaCl（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：S271，CAS 7647-14-5）
琼脂，细菌，超纯（Thermo Scientific，目录号：J10906，CAS 9002-18-0）
蛋白胨（BD Bioscience，BD Bacto TM ，目录号：211677）
六水合氯化钙（Sigma-Aldrich，目录号：442909）
硫酸镁（Sigma-Aldrich，目录号：208094）
磷酸氢二钾（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
磷酸二氢钾（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C75209）
纯酒精200证明（Pharmco产品，目录号：111000200）
胰蛋白胨（BD Bioscience，BD Bacto TM ，目录号：211705）
酵母提取物（BD Bioscience，BD Bacto TM ，目录号：212750）
指甲油
线虫生长培养基（NGM）琼脂（见食谱）
1 M CaCl 2 （见食谱）
0.5 M MgSO 4 （见食谱）
1 M磷酸钾（pH 6）（见食谱）
5毫克/毫升胆固醇（见食谱）
LB琼脂（见食谱）
LB（见食谱）
OP50-1文化（见食谱）

设备

Amsco ®世纪SV-120科学预真空灭菌器（STERIS）
4升烧瓶
搅拌棒
搅拌盘
PourBoy ® 4无菌培养基分配器（Tritech TM 研究）
自制细胞分布器（玻璃巴斯德吸管通过加热弯曲，扩展器尺寸小于1英寸。）
37°C培养箱（VWR，型号：1535）
Incubator Shaker（Eppendorf，New Brunswick Scientific，型号：I2500，目录号：M1284-0000）
用于 C的20°C培养箱。线虫文化（Intellus控制系统）（PERCIVAL，型号：I-36NL）
自制的蠕虫捡拾器，带有5¾玻璃巴斯德吸管（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：13-678-6A）和铂丝（Scientific Instrument Services，Inc。，目录号： W414）
徕卡PLANAPO 2.0x物镜的荧光立体显微镜（徕卡显微系统，型号：Leica M165FC）
共聚焦激光扫描显微镜平台（徕卡显微系统，型号：Leica TCS SP8）配Leica CTR6500电子盒

软件

GraphPad Prism 7.0a（GraphPad Software，Inc.， www.graphpad.com ）＆nbsp;
Leica Application Suite高级荧光（徕卡显微系统）

第一部分：外阴表型分析

程序

同步种群并种植蠕虫（图2A）
1. 将20只一日龄成虫（在子宫中大约有10个卵子）转移到接种 E的60mm NGM平板上。大肠杆菌（OP50-1）。
  注意：如果您感兴趣的突变体具有较小的育雏大小或产卵缺陷，您可能需要将更多的蠕虫转移到每个平板上。＆nbsp;
2. 每个菌株制备5个重复的平板。
3. 让他们产卵两个小时。每个板需要超过五十个鸡蛋。如果每个板的蛋数少于50个，请返回步骤A1并增加每个板中成虫的数量。
4. 去除成虫。
5. 让后代生长，直到它们在20℃达到L4阶段（~48小时）。 L4阶段可以通过外阴区域的小白色新月点以及蠕虫的大小来区分（Fielenbach和Antebi，2008）。
分析外阴表型（图2B）

图2.外阴表型分析的流程图。：一种。蠕虫群体的同步。从年轻成虫中收集鸡蛋两小时，然后将它们培养约48小时直至它们达到L4阶段。 B.外阴表型分析。计算第0天的蠕虫总数。红色X表示显示外阴表型的蠕虫。计算显示外阴缺陷的蠕虫并将其移除以避免在接下来的几天重复计数。
1. 一旦到达L4阶段，就计算L4蠕虫的总数。通常，每个板具有大约一百个蠕虫。
2. 24小时后，检查并移除显示突出的外阴或套袋的蠕虫。继续计数和审查3天。
3. 计算外阴缺陷的百分比（Zhang et al。，2018）。

数据分析

每种菌株应分析250多种蠕虫，并应进行三次独立实验。
使用以下等式计算具有外阴缺陷的蠕虫的百分比：
在GraphPad Prism中输入值，用SEM和 P -value分析平均值，用双尾学生 t - 测试。

第二部分：Alae表型分析（图3）

程序

如上所述同步蠕虫。
将年轻成人或L3动物转移到新的平板上。每板放置10只动物。每个菌株重复5次。＆nbsp;
分析alae表型。在立体显微镜下，将焦点放在24x物镜下的每个蜗杆的上侧。你会看到从头到尾的虫子上侧的突出的脊。观察alae并记录每只动物的完整，停止或缺失。有关alae表型，请参阅Slack et al。，2000。在成人阶段，停止或不存在alae是异常的，而在L3阶段alae的存在是异常的。
计算完整，已停止或缺少alae的蠕虫数量（Zhang et al。，2018）。

图3. alae表型分析的流程图。当同步的蠕虫到达特定阶段时，将10个蠕虫转移到新的平板中，并在显微镜下分析alae表型。

数据分析

对于每个菌株，观察到至少50个蠕虫并且进行三个独立的实验。
计算有异常的蠕虫的百分比。
使用GraphPad Prism计算具有双尾学生 t - 测试的SEM和 P 值的均值。

第三部分：皮下接缝细胞数量的分析

程序

使用JR672生成表达P scm :: gfp 的所需菌株（图4）

图4. P scm :: gfp 表达突变体的遗传杂交示意图。 JR672与野生杂交获得表达GFP的杂合子雄性的雄性，其在第4天与感兴趣的突变体交配。然后，F2代中表达GFP的雌雄同体是双杂合子。使用孟德尔分离，来自F2代的双杂合子将产生双纯合子，当两个突变没有连锁时，具有1/16的机会。然而，由于我们只选择表达GFP的蠕虫，因此双纯合子的机会增加到1/12。 F3中的绿色框表示表达GFP的蠕虫的可能基因型，红色框表示双突变体的基因型。
1. 通过在60 mm平板的中间接种20μlOP50来准备用于杂交的NGM板。通过制作小的细菌草坪，蠕虫交配的机会增加。
2. 将菌株JR672的雌雄同体与N2雄性杂交。雌雄同体与雄性的比例通常为1：3。＆nbsp;
3. 在第3天，移除父蠕虫以避免混合两代。
4. 在第4天，选择F1雄性，它们是GFP阳性杂合子，与您感兴趣的突变体的雌雄同体建立杂交。保持雌雄同体与雄性比例为1：3。
5. 在第6天，从盘子中移除父蠕虫。现在，预计只有F2代作为幼虫或盘中的蛋。
6. 在第7天，选择在皮下接缝细胞中表达GFP的雌雄同体。如果交配成功，有50％的机会获得表达GFP的雌雄同体。克隆了几个表达GFP的雌雄同体，每个种子板一只动物。
7. 在第9天，从板上移除母虫。
8. 在第10天，选择一个具有大量蠕虫的平板。丢弃其余的盘子。从选择的平板中，挑出表达GFP的蠕虫。如果突变不在与GFP基因座相同的连锁群中，则获得双突变体的机会是十二分之一，因为仅选择表达GFP的蠕虫进行分析。基于获得双突变体的机会，选择适当数量的F3蠕虫。为了增加获得双突变体的可能性，选择三到四倍的蠕虫数量。如果感兴趣的突变与P scm :: gfp 无关，我们通常会选择40种蠕虫。请注意，P scm :: gfp 位于连锁组V.
9. 在第12天，为感兴趣的突变基因型F3蠕虫并选择具有纯合子的平板。检查具有纯合突变体的平板，并鉴定具有GFP表达阳性的所有F4动物的平板。如果需要，可以在F3代中通过PCR选择GFP纯合子。
同步和准备用于显微镜的蠕虫
1. 为了获得同步的动物群体，允许10到20只可繁殖的成虫在2小时产卵并让它们生长，直到它们达到20℃的L4阶段，如第I部分程序A所述。
2. 如前所述，在成像载玻片上制备2％琼脂糖垫（Huynh et al。，2018）。
3. 将10个L4蠕虫置于2％琼脂糖垫上的7μl10mM左旋咪唑中，盖上盖玻片并通过用透明指甲油涂覆盖玻片的四个角来稳定盖玻片。
4. 在40倍物镜下，检查GFP信号。 GFP在皮下接缝细胞的细胞核中表达。野生型蠕虫在L4阶段每侧有16个皮下接缝细胞（图5），因此每个蠕虫的皮下接缝细胞总数为32.通过上下聚焦，计算每侧皮下接缝细胞的数量。在尾部，左右皮下接缝细胞的焦平面比其他细胞更接近。因此，通过计算从头到尾和从尾到头的另一侧细胞的一侧，可以更容易地计算皮下接缝细胞的总数。
  
  图5.野生型 scm :: gfp 的GFP表达模式 ℃。线虫。 A. GFP在皮下接缝细胞的细胞核中表达。在该图像中使用40倍物镜。 B.在野生型 C中显示了十六个皮下接缝细胞。 10x物镜下的线虫。涂片GFP信号来自皮下接缝细胞的另一侧（Zhang et al。，2018）。

数据分析

分析每个菌株至少30个蠕虫来计算接缝细胞，并进行三次独立实验。
计算每个蠕虫的皮下接缝细胞总数，并使用GraphPad Prism计算双尾学生 t - 测试的平均值，SEM和 P 值。

笔记

JR672的基因型是 wIs54 [P scm :: gfp ] V.注意P scm :: gfp 转基因位于染色体V上。＆NBSP;
GFP信号在幼虫期比在成年期更强。因此，一旦它们到达L4阶段就选择表达GFP的蠕虫。

食谱

线虫生长培养基（NGM）琼脂（2升）
1. 在4升烧瓶中加入以下成分：
  NaCl 6.0克
  琼脂，细菌，超纯34克
  Bacto蛋白胨5克
  dH 2 O 1,950 ml
  注意：在用低等级琼脂制备的平板上，蠕虫不能很好地生长。
2. 加入搅拌棒搅拌均匀。将搅拌棒留在烧瓶内
3. 准备1升dH 2 O清洗PourBoy ® 4无菌介质分配器的管子，并用铝箔包裹管子
4. 高压灭菌NGM，dH 2 O和用于PourBoy ® 4无菌介质分配器的管在Amsco ® Century SV-120 Scientific中使用液体45分钟循环预真空灭菌器
5. 冷却搅拌盘上的NGM，直至达到约55°C。同时，准备200个60毫米培养皿
6. 一旦NGM冷却，添加以下成分：
  2毫升1M CaCl 2
  4毫升0.5M MgSO 4
  50毫升磷酸钾（pH 6）和2毫升胆固醇（5毫克/毫升乙醇）
7. 搅拌均匀。 NGM变得多云是可以的
8. 使用PourBoy ® 4无菌培养基分配器将10 ml NGM分配到60 mm培养皿中。将NGM板在室温下干燥几天
9. 种子OP50-1作为 C的食物来源。线虫。在每个平板中加入约100μl的OP50-1，并使用自制的细胞分布器扩散细菌，制成一小圈细菌草坪。细菌草坪不应接触板的边缘。然后，在室温下培养OP50-1过夜
1 M CaCl 2
1. 将21.9克氯化钙六水合物（CaCl 2 •6H 2 O）溶于90毫升dH 2 O中
2. 一旦溶解，加入更多dH 2 O，制成100 ml的1M CaCl 2
3. 使用0.22μm过滤装置过滤灭菌
0.5 M MgSO 4
1. 将12.03克硫酸镁（MgSO 4 ）溶于90毫升dH 2 O中
2. 一旦溶解，加入更多dH 2 O，制成100 ml 0.5 M MgSO 4
3. 在Amsco ® Century SV-120 Scientific Prevacuum Sterilizer中以45分钟的液体循环高压灭菌
1 M磷酸钾（pH 6）
1. 通过将17.42g磷酸氢二钾溶解在dH 2 O中制备100ml的1M K 2 HPO 4
2. 通过将13.61g磷酸二氢钾溶解在dH 2 O中制备100ml的1M KH 2 PO 4
3. 取13.2ml 1MK 2 HPO 4 并加入86.8ml 1M KH 2 PO 4 制成1 M磷酸钾
4. 在Amsco ® Century SV-120 Scientific Prevacuum Sterilizer中高压灭菌1M磷酸钾，液体循环45分钟
5毫克/毫升胆固醇
将0.5克胆固醇溶于100毫升乙醇中
LB琼脂
1. 添加以下成分：
  NaCl 2.5克
  胰蛋白胨2.5克
  酵母提取物1.25克
  琼脂3.75克
  dH 2 O至250毫升
2. 用搅拌棒和高压釜充分混合，液体循环45分钟
3. 将其冷却至55℃并加入250μl50mg/ ml链霉素
4. 将其在搅拌板上搅拌并倒入100mm培养皿中
5. 将板在板凳上干燥过夜
LB
1. 添加以下成分：
  NaCl 10克
  胰蛋白胨10克
  酵母提取物5克
  dH 2 O至1升
2. 通过搅拌和高压釜溶解45分钟的液体
OP50-1文化
1. 在含有链霉素的LB琼脂平板上划线OP50-1
2. 在37°C培养箱中培养OP50-1过夜
3. 从LB琼脂平板上挑取一个OP50-1菌落，在含有50μg/ ml终浓度的链霉素的LB中于37℃振荡培养箱中培养过夜。

致谢

这项工作得到了NIH（NS074324，NS089616），约翰霍普金斯大学ALS研究的Robert Packard中心，ALS协会和肌肉营养不良协会的资助。

利益争夺

作者没有利益冲突或竞争利益申报。

参考

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