材料和试剂

过滤P1000提示DF1000ST（Gilson，目录号：F171705）
过滤后的P200提示DF200ST（Gilson，目录号：F171503）
过滤后的P20提示DF30ST（Gilson，目录号：F171303）
盖玻片22 x 22 mm（VWR，目录号：631-0125）
血清移液管10 ml无菌（Greiner Bio-One，目录号：607180 / 10ml）
细胞培养6孔板，平底，组织培养处理（Eppendorf，目录号：0030720113）
细胞培养24孔板，平底，组织培养处理（Eppendorf，目录号：0030722116）
细胞培养96孔板，平底，组织培养处理（Eppendorf，目录号：0030730119）
K3-EDTA真空采血管（C.D.RICH，目录号：CDRP007）
锥形管15 ml（Corning，目录号：CLS430790）
锥形管50 ml（Corning，目录号：CLS430828）
巴斯德塑料移液器，3 ml，无菌（Fisher Scientific GmbH，目录号：3124975）
Microcentrifuge Tube，1.7 ml，Snap Cap，Clear，sterile（Corning B.V.，目录号：3621）＆nbsp;
无菌血液注射器，20 ml（Nipro，目录号：200812）
Low-Tox-H兔子补体（Cedarlane，目录号：CL3331）
Ficoll Histopaque-1077（Sigma-Aldrich，Merck Millipore，目录号：10771-100ML）
台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，Merck Millipore，目录号：T8154-100ML）
RPMI 1640细胞培养基（Sigma-Aldrich，Merck Millipore，目录号：R7388-100ML）
不含酚红的RPMI 1640细胞培养基（Gibco，目录号：11835-063 500ML）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，Merck Millipore，目录号：F2442-500ML）
注意：胎牛血清必须在55°C加热灭活1小时。
抗生素 - 抗真菌药物100x（Sigma-Aldrich，Merck Millipore，目录号：A5955）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，Merck Millipore，目录号：D8537-500ML）
XTT细胞增殖检测试剂盒（Trevigen，目录号：4891-025-K）
丝裂霉素C（Sigma-Aldrich，Merck Millipore，目录号：M0503）

设备

Pipetman入门套件（Gilson，目录号：F167300）
CappTempo电动移液器控制器（Capp，目录号：T100-B）
细胞计数室Neubauer（Marienfeld，目录号：0640010）
安全柜Safeflow 1.2（BioAir，目录号：LD60000）
CO 2 孵化器（Heraeus，型号：BB6220）
倒置显微镜（蔡司，型号：Axiovert 40C）＆nbsp;
Varispeed冷冻离心机（Centurion Scientific，型号：K280R）
加热浴循环器（劳达，型号：M20）
冰箱细胞板离心机（Eppendorf，型号：5810R）
多模板读卡器（Perkin Elmer，型号：Enspire）
微量离心机（Eppendorf，型号：5415 R）
任何用作冰桶的聚苯乙烯泡沫塑料盒

软件

SPSS软件（版本13; SPSS Inc，芝加哥，IL，USA）（用于数据的统计分析）

程序

血液采集
注意：＆nbsp;
1. 为了排除预致敏事件，优选没有输血史或先前器官移植的男性受试者。受试者必须健康且无关联。
2. 必须从参加研究的每个人那里获得书面知情同意。
3. 您受尊敬的研究所/国家的伦理委员会必须正式批准您的研究，并提供研究方案编号。
4. 整个过程需要无菌条件，强烈建议使用无菌试剂和塑料制品。＆nbsp;
1. 使用无菌血液注射器，从每个人抽取约20毫升血液，并立即将其分配到预先标记的K3-EDTA真空采血管（一管/供体）中。＆nbsp;
2. 将管倒置数次以使血液与K3-EDTA正确混合，并将收集管保持在冷环境中（4℃，孵育时间不超过2小时），直到PBMC分离开始。
PBMC隔离
注意：＆nbsp;
1. 整个过程必须在无菌柜（罩）内进行。
2. 无论是使用摆动式离心机转子，还是使用固定角度的转子，都不会显着影响隔离式PMBC的总数。
3. 在步骤B1期间，应该非常轻柔地在Ficoll Histopaque上进行血液分层，以免干扰Ficoll层（Ficoll可以消除死细胞）。
4. 遵循这些说明，适当的分离应该产生1.8-2.3×10 6 PBMC / 1ml健康个体的血液。
5. 血液与Ficoll Histopaque体积的比例应为1：1。
1. 根据收集的血液量，将每个供体的相同总体积的Ficoll加入50ml锥形管中。用塑料巴斯德吸管在Ficoll表面慢慢加入每个人的血液，不要打扰它。
2. 立即在室温（RT）下将含有Ficoll和血液的管在400 x g 离心25分钟。确保离心机的减速速度为0。
3. 使用无菌塑料巴斯德吸管小心地破坏血浆层，并且在不干扰Ficoll Histopaque层的情况下，吸出在血浆和Ficoll Histopaque之间的间期形成的白色PBMC层（“血沉棕黄层”）（图2）。将PBMC倒入一个新的15毫升锥形管中。
  
  图2. PBMC的分离。 Ficoll Histopaque和全血在（A）和（B）离心之前的层，显示锥形管中的层分离。
4. 对于收集的每种PBMC，将不含酚红的RPMI 1640细胞培养基加至15ml。
5. 通过在室温下以315 x g 离心样品10分钟来沉淀PBMC。将减速速度恢复正常（Centurion Scientific离心机上为6）。
6. 除去上清液，用10ml不含酚红的RPMI 1640细胞培养基洗涤细胞沉淀，并在室温下以315 x g离心样品10分钟。
7. 除去上清液，用2ml完全RPMI培养基（10％FBS，1％抗生素 - 抗真菌溶液）重悬每个细胞沉淀，并用Neubauer室计数。将90μl台盼蓝溶液和10μl细胞混合到干净的Eppendorf管中，加载Neubauer室并立即在显微镜下以最低放大倍数开始计数。用台盼蓝溶液长时间涂抹所有细胞染成蓝色。始终计算出看起来像球形白细胞的活细胞。台盼蓝的使用允许区分死细胞与活细胞，因为死细胞被染成蓝色。在（Phelan和Lawler，2001）中讨论了使用Neubauer室进行细胞计数的详细方案。
体液同种异体的评估
注意：
1. 如上所述，步骤C1f中的7天潜伏期对于IgM和IgG同种抗体的发展是必需的。任何药物治疗都应持续整个期间。
2. 在步骤C3a期间，播种适当数量的细胞，以产生足够的孔以评估未处理细胞，处理细胞和对照细胞的体液免疫。我们建议进行9到12次相同的实验，每次一式三份，结果应参考三次测量的平均值。
3. Low-Tox-H兔补体作为冻干化合物提供。在使用Low-Tox-H兔补体之前不久，用1ml冰冷的蒸馏水重建（在步骤C3f期间在冰上孵育30分钟期间重建）。根据制造商的说明，补充剂必须在4°C下储存，最多可在重建后保存一小时。＆nbsp;
4. 可以使用能够分别读取490 nm和630 nm波长的ELISA板读数器。
5. 确保在用ELISA读板机读取板之前去除XTT 96孔板中形成的任何气泡。任何泡沫或气泡都会对OD读数产生负面影响。注射器的尖端最适合去除泡沫或泡沫。
1. 准备单向MLR
  1. 用来自每个样品的完全RPMI重悬0.5μl 6 PBMC在500μl中，并将它们转移到无菌的1.7ml微量离心管中。在50℃下用50μg/ ml丝裂霉素C处理它们30分钟。这些是刺激细胞。
  2. 在室温下以300μL离心细胞5分钟，除去上清液并用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞。
  3. 再重复步骤C1b两次。
  4. 将种子0.5×10 6个刺激细胞/孔重悬于250μl完全RPMI中，加入24孔板中。＆nbsp;
  5. 向已经含有0.5×10 6个刺激细胞的每个孔中，加入来自不同供体的0.5×10 6个静息PBMC（重悬于250μl完全RPMI）;这些是应答细胞（例如，来自供体A的刺激细胞和来自供体B的应答细胞）。共同刺激物和应答细胞构成MLR。
  6. 将MLR在37℃下在CO 2 培养箱中孵育7天，有或没有您正在调查的处理。应在7天潜伏期开始时加入选择治疗。在为期7天的孵化期间，不得更换培养基。＆nbsp;
2. 静息PBMC的制备
  1. 与制备单向MLR（步骤C1a-C1f）同时，应制备静息PBMC样品。将1×10 6个 PBMC重悬于2ml完全RPMI中，并将细胞转移到6孔板的一个孔中。根据需要准备多个井。这些细胞是静息的PBMC。
  2. 将孵育的静息PBMC在37℃下在CO 2 培养箱中孵育7天，在7天孵育期间不改变培养基。
3. 抗体介导的补体依赖性细胞毒性
  1. 一旦7天的时间结束，计算每个孔中可存活的静息PBMC。从每个静息的PBMC样品中计数细胞是费力的。必须对每个样本进行，因为它将确保静息细胞的准确计数，排除7天期间的增殖或凋亡率，这可能在来自不同献血者个体的PBMC群体之间有很大差异。＆nbsp;
  2. 计数后，将0.5×10 5个静息PBMC重悬于50μl完全RPMI中，并将50μl细胞/孔接种到平底96孔板中。上述静息PBMC必须来自同一个体，该个体也提供单向MLR的刺激物PBMC（如图1所示，例如，PBMC A个体）。体液同种异体免疫将在提供应答者PBMC的人中进行评估（如图1所示，例如，应答者PBMC B个体）。
  3. 一旦7天结束，将来自步骤C1f的含有MLR的每个24孔板在Cell平板离心机上以300μL离心10分钟，在室温下离心10分钟。
  4. 收集每个MLR的上清液。上清液的体积应为约450-500μl。在处理和移液过程中请保持温和，以免意外地接收任何离心的细胞。
  5. 从每个MLR上清液或50μl完全RPMI（对照）中加入50μl到含有静息靶PBMC的96孔板的孔中。此外，在空孔中加入100μl完全RPMI，其将用作XTT测定的空白孔。建议生成9到12个对照孔用于统计分析。
  6. 将96孔板在冰上孵育30分钟。
  7. 孵育30分钟后，在每个孔（样品，对照，空白）中加入11μl兔补体Low-Tox-H兔补体（10％[v / v]，工作浓度），终浓度为10％。现在每个孔的总体积应为111μl。＆nbsp;
  8. 将96孔板在37℃下在CO 2 培养箱中孵育2小时。
  9. 在培养期结束之前，立即从XTT测定试剂盒制备XTT工作溶液，该试剂盒将用于通过比色法测量细胞存活。简言之，根据制造商的方案，将100μlXTT活化剂加入5ml XTT试剂中，以制备XTT工作溶液。＆nbsp;
  10. 一旦孵育2小时（步骤C3i），将50μlXTT工作溶液加入96孔板的每个孔中并轻轻混合。＆nbsp;
  11. 在CO 2 培养箱中将板在37°C下再放置一小时。＆nbsp;
  12. 使用设置为490 nm的ELISA板读数器读取样品的吸光度，并在630 nm处进行参考校正。
  13. 在减去来自空白孔的背景OD值之后，通过以下等式计算每个样品中的细胞存活：细胞存活率（％）=（评估条件的XTT测定OD /对照的XTT测定OD）×100。细胞越少存活，单向MLR中同种抗体的产生越高，因此体液同种异体的效力越强。

数据分析

我们建议对每种不同的条件执行至少9到12个单向MLR，例如有或没有各种测试物质，一式三份运行。一旦评估了所有细胞存活率（步骤C3m），您就可以将数据实施到SPSS软件中。如果评估两个条件，则应使用配对 t -test进行平均值比较，因为每个MLR（由来自两个不同供体的PBMC组成）在人类受试者的实验中是独特的。对于两个以上的评估条件，应使用单向重复测量ANOVA，然后进行Bonferroni校正测试。如果您将此方案应用于两种不同的小鼠品系，并且您认为每种菌株的受试者是遗传匹配的，未配对的 t - 测试和单因素方差分析，然后分别进行Bonferroni校正测试是适当的统计测试。
＆NBSP;图3中描绘了抗体介导的CDC的实例，其显示特异性蛋白酶体抑制剂CEP18770在10nM浓度下对体液免疫的抑制。蛋白酶体在细胞蛋白质周转和蛋白质稳态中起关键作用。此外，众所周知，浆细胞对蛋白酶体抑制敏感，因为它们产生大量抗体并因此表现出高蛋白质转换。浆细胞中蛋白酶体的直接抑制导致蛋白质转换受损，引起未折叠的蛋白质反应，反过来又会诱导细胞凋亡（Walsh et al。，2012）。所公布的结果使蛋白酶体成为移植领域新型免疫抑制药物开发的优秀目标（Eleftheriadis et al。，2017a）。

图3.蛋白酶体抑制剂CEP-18770有效抑制体液同种异体免疫。单向MLR在存在或不存在10nM CEP-18770的情况下进行7天。收集上清液并用于针对静息靶PBMC的抗体介导的CDC测定，所述静息靶PBMC类似于在各MLR中用作刺激细胞的那些。源自CEP-18770处理的MLR的上清液显示出比来自未处理的MLR的上清液更小的抗体介导的CDC。标记为*和＃的标记表示 P ＆lt; 0.05比较条件。误差线对应于SD。进行了12次这样的实验，每次都是一式三份，结果是指三次测量的平均值。

笔记

在XTT测定期间不应出现OD之间的不一致的变异性，并且一式三份确保数据的再现性。我们通过多次执行此协议获得了一致的结果。基于该方案的三项研究已经发表（Eleftheriadis et al。，2017a，2017b和2017c）。

致谢

由卫生部和教育，研究和宗教事务部资助的Thessaly大学医学院肾脏科的资金来源为该协议的制定提供了资金。

利益争夺

利益声明：未申报。

伦理

从参加研究的每个个体获得知情同意，希腊拉里萨医学院Thessaly大学伦理委员会批准了研究方案（批准数量：558 / 10-2-2017）。

参考

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Eleftheriadis，T.，Pissas，G.，Antoniadi，G.，Liakopoulos，V。和Stefanidis，I。（2017a）。蛋白酶体和免疫蛋白酶体抑制细胞和体液同种免疫的比较分析。 Int Immunopharmacol 50：48-54。
Eleftheriadis，T.，Pissas，G.，Mavropoulos，A.，Liakopoulos，V。和Stefanidis，I。（2017b）。有氧糖酵解抑制剂二氯乙酸盐和克雷布斯循环抑制剂LW6对细胞和体液的影响比较alloimmunity。 Biomed Rep 7（5）：439-444。
Eleftheriadis，T.，Pissas，G.，Sounidaki，M.，Antoniadi，G.，Antoniadis，N.，Liakopoulos，V。和Stefanidis，I。（2017c）。在人类细胞培养中，依维莫司在抑制细胞同种异体免疫方面不如他克莫司，但在体液方面同样有效alloimmunity。 Int Urol Nephrol 49（9）：1691-1697。
Konishi，E.，Kitai，Y。和Kondo，T。（2008）。利用补体依赖性细胞毒性来测量低水平的抗体：在模型中应用于非结构蛋白1流行性乙型脑炎病毒。 Clin Vaccine Immunol 15（1）：88-94。
Phelan，M。C.和Lawler，G。（2001）。细胞计数。 Curr Protoc Cytom 附录3：附录3A。
Rumke，H.C.，Terpstra，F.G.，Huis，B.，Out，T.A。和Zeijlemaker，W。P.（1982）。人类混合淋巴细胞培养物中的免疫球蛋白生成：对患者和健康供体细胞共培养的影响。 J Immunol 128（2）：696-701。
Sato，T.，Deiwick，A.，Raddatz，G.，Koyama，K。和Schlitt，H.J。（1999）。双向混合白细胞培养物（MLC）中同种异体人单核细胞的相互作用：细胞的影响数字，亚群和环孢菌素。 Clin Exp Immunol 115（2）：301-308。
Walsh，R.C.，Alloway，R.R.，Girnita，A.L。和Woodle，E。S.（2012）。基于蛋白酶体抑制剂的抗体介导排斥治疗。肾脏Int 81（11）：1067-1074。