3 140 术后疼痛极易使人衰弱并阻碍康复。阿片类药物是用于急性术后疼痛的主要止痛药。鉴于全美的阿片类药物成瘾性严重和药物过量流行，迫切需要非阿片类药物止痛药。为了开发用于治疗术后疼痛的新颖的非阿片类药物疗法并确定这种疼痛的潜在机制，已建立了切开性疼痛的啮齿动物模型。本文中的协议详细描述了如何创建适用于既定协议的术后疼痛的小鼠模型。术后疼痛的这种模型是经常使用的，高度可复制的，并且会导致周围和中枢神经系统的改变。【背景】术后疼痛是一个重大的全球性问题。每年大约有2.342亿人接受大手术（Weiser等人，2008年），约80％的患者经历了急性术后疼痛（Gan，2017年）。其中，约10％至50％的患者会发展为慢性疼痛，并继续严重影响其生活质量（Chapman and Vierck，2017）。与术后慢性疼痛发展相关的因素之一（但不太可能是原因）是术后第一周出现的急性疼痛的严重程度（Fletcher > et al。，2015; Chapman and Vierck， 2017）。阿片类药物是用于急性术后疼痛的主要止痛药（Sen和Bathini，2015年； Tan >等人，，2018年）。考虑到阿片类药物的流行，需要非阿片类药物的止痛药。因此，为开发可能最终降低慢性术后疼痛的严重程度和/或发生率的术后疼痛的最佳疗法，确定急性术后疼痛的基础机制是必要的。已将大鼠（Brennan等人，1996年）和小鼠（Pogatzki和Raja，2003年）的急性切开疼痛模型开发为临床前模型，以鉴定术后疼痛的分子，细胞和生理机制。但是，缺少对小鼠术后疼痛模型的详细描述。在这里，我们详细描述了需要切除皮肤和肌肉的术后疼痛的小鼠模型。皮肤和肌肉的切开最好模拟侵入性手术，该手术会引起剧烈的急性疼痛并导致慢性疼痛（Brennan，2011; Chapman and Vierck，2017）。此外，皮肤和肌肉的切口（〜6天）产生的超敏反应比仅皮肤的切口模型（〜3天）持续的时间更长（Xu和Brennan，2010）。在该协议中，我们提供了根据先前协议（Brennan等，1996； Pogatzki和Raja，2003）开发的详细，循序渐进的方法，用于开发术后疼痛的小鼠模型。

材料和试剂

不锈钢无菌11号手术刀片（World Precision Instruments，羽毛安全剃刀有限公司，目录号：504170）
无菌5-0尼龙手术缝合线（AD Surgical，Unify，货号：S-N518R13）
手术胶带（3M，Transpore，货号：1527-0）
棉签（VWR，临界棉签，货号：89031-270）
Glad Press'n Seal（SAI输液技术，Glad，目录号：PSS-70）
无菌丁腈手套（Kimberly-Clark Professional，Kimtech Pure，目录号：HC61170）
培养皿[VWR，14.5和9 663161，Greiner Bio-One，目录号：82050-912（小）和82050-600（大）]
无菌纱布（Alleded Medical，Ardes，目录号：GA441221）
Sharpie特细永久标记（Staples，Sharpie，目录号：37001）
8-16周大的C57BL / 6J小鼠（JAX，目录号：000664）
杆菌肽锌软膏（Fougera Pharmaceuticals Inc，目录号：0168-0011-04）
异氟烷（Clipper Distribution Company LLC。，Phoenix，目录号：0010250）
75％的乙醇（Fisher Scientific，Decon Laboratories，Inc.，目录号：22-281-562）
手术擦洗7.5％聚维酮碘（贝他定，兽医，目录号：67618-154-01）
眼部润滑剂（Patterson兽医，眼科Optixcare，目录号：07-893-2779）

设备

1,000 ml烧杯（VWR，PYREX，货号：13912-284）
＃55 Dumostar镊子（Fine Science Tools，Dumont，目录号：11295-51）
手术刀手柄（精细科学工具，目录号：10003-12）
虹膜镊子，10厘米，弯曲，锯齿状（World Precision Instruments，目录号：15915）
Halsted蚊子止血钳，12.5厘米，直式（World Precision Instruments，目录号：15920-G）
Vannas剪刀，弯曲的8厘米（World Precision Instruments，目录号：14122）
小动物手术板（Braintree Scientific，Inc.，CD +，目录号：ACD 014）
异氟烷分配器（Highland Medical Equipment，Drager，目录号：16-7001）
滑动顶部异氟烷感应室（肯特科学公司，目录号：VetFlo-0530LG）
带垫热疗泵（Adroit Medical Systems，目录号：HTP-1500）
等温垫（Braintree Scientific，Inc.，Deltaphase，目录号：DPIP）
数字卡尺（VWR，目录号：62379-531）
Steri 250珠灭菌器珠浴（实验室无限，西蒙·凯勒有限公司，目录号：4AJ-6286283）
微波炉（Emerson，1,000 W，目录号：B007Q45CIS）
装有Aspen Sani Chips ®（PJ Murphy Forest and Products，Sani Chips ®）的家用笼

软件

GraphPad棱镜7

程序

用乙醇对手术区域进行消毒，并在至少325°C的珠浴中对工具进行消毒30 s。将无菌工具，缝线和刀片放在无菌纱布上。
将热疗法泵垫加热至41°C，然后在微波炉中将等温垫加热1分钟。将新的干净家用笼子放在热疗泵垫上。将实验室用纸巾放在温暖的等温垫上，并盖上无菌Press'n Seal和手术台。
为了引起麻醉，将鼠标放在装有1 ml异氟烷的纸巾上的烧杯腔中（图1），并等待大约30 s或直到鼠标不再正确。或者，可以使用异氟烷分配器随附的异氟烷诱导室来诱导麻醉。

图1.简短的吸入麻醉。通过在室内用1 ml异氟烷吸入将小鼠短暂麻醉。
从异氟烷腔中快速移出鼠标，并用棉签向每只眼睛涂抹眼油。通过将小鼠的头部放入与异氟烷分配器相连的鼻锥中，用1.5％-2％吸入的异氟烷进一步麻醉小鼠，并用无菌Press'n Seal盖住小鼠（指定用于手术的后爪除外）（图2）。

图2.持续吸入麻醉。小鼠通过鼻锥和1.5％-2％异氟烷连续麻醉。

有关步骤5-13 ，另请参见视频1。
视频1.足底切口手术。该视频显示了如何通过对足底皮肤和指趾短屈肌进行切开来制作术后疼痛模型（该视频由威斯康星州医学院和美国是根据动物保健指南进行的，并由威斯康星州医学院的动物研究伦理委员会根据协议＃0383批准。
用手术胶带将脚趾向下敲打，将后爪粘在表面上（图3）。

图3.将后爪固定到手术表面。用手术胶带将后爪固定在表面上。
固定后爪后，先用75％乙醇的棉签擦拭，再用新的甜菜碱棉签擦拭。重复总共3个应用程序。
使用数字卡尺从脚后跟的近端边缘测量2毫米，并在后爪中间的此位置放置一个带有永久标记的点。从第一个点开始，朝后脚中央的脚趾方向测量5毫米，然后放置第二个点（图4）。

图4.切口的测量。在后爪中间放置两个点，距离脚后跟一个2毫米，另一个距离第一个点5毫米。
用镊子轻轻捏住最内侧的脚趾（最有可能无法用手术胶带固定该脚趾），以检查鼠标是否已完全麻醉。如果鼠标退缩，请等到鼠标不再对脚趾捏起反应后再继续执行步骤9。
通过将镊子放在脚跟的每一侧来稳定后爪，并从第一个点到第二个点在皮肤和筋膜上进行纵向切口（图5）。

图5.皮肤切口。用11号手术刀切开5毫米的纵向切口。
用镊子使皮肤远离屈指短肌。通过将弯曲镊子的一端插入屈指短肌的外侧边缘下方，并将镊子推入肌肉的内侧，来提升屈短指短肌。

图6.屈短指短肌高程。将弯曲的镊子插入短屈指短肌下方以升高肌肉。
用手术刀从源头和插入处穿过整个腹部进行纵向切口，注意不要从源头和插入处完全切断肌肉，确保将腹部切成两半（图7）。

图7.肌肉切口。从皮肤切口的近端到远端，通过高位屈指短肌的肌肉腹部进行纵向切口。
要缝合伤口，请从肌肉下方取下弯曲的镊子，并用镊子抬高伤口周围的皮肤边缘。通过使用5-0尼龙缝线和止血器在皮肤（但不包括肌肉）中以大约2 mm的间隔放置两条缝线来闭合伤口（图8）。

图8.皮肤缝合。用两个5-0尼龙缝线闭合皮肤。
用棉签在伤口上涂抹大量杆菌肽软膏，然后将鼠标放在步骤2中位于热疗泵垫上的新笼子中。

数据分析

用GraphPad Prism 7软件确定统计显着性，并且图显示为平均值±SEM。具有Sidak post hoc的双向ANOVA用于确定机械和热阈值的统计显着性。Cowie等人（2018）提供了用于分析机械和热阈值行为数据的统计信息的完整说明。

笔记

重要的是尽快执行手术，以减少重复麻醉的必要性以及麻醉带来的任何副作用。在我们的实验室中，需要经过培训的外科医生大约5分钟才能执行此过程。
作为对照，通过如下步骤进行假手术：对小鼠进行麻醉，如步骤5中那样对后爪进行消毒，并且将杆菌肽软膏施用于足底后爪。
如果在操作过程中发生出血，请用棉签对切口部位施加压力，直到出血停止为止。
小鼠被安置在一起。
手术后无需进行任何护理，除了可以监控缝合线。
如果在术后第3天之后使用小鼠，则在术后第4天去除缝线。由于伤口闭合不良，必须在术后2天之前拔出缝线的小鼠从研究中移除。
为获得一致的行为结果，请对足后爪的内侧-后侧施加机械刺激和热刺激（图9）。该区域在基线时最不敏感，因为脚后跟负重，而垫附近的其他区域更敏感，并且退缩阈值可变。因此，使用提供始终如一的高基线撤回阈值的脚后跟区域可以最好地检测出切口造成的变化（Brennan等，1996）。使小鼠在置于网状平台（机械阈值）或玻璃平台（热阈值）上的有机玻璃室内适应1小时。将校准的von Frey单丝（0.09至19.6 mN）应用于足后爪，并使用上下方法计算每只动物的撤离阈值（Dixon，1980; Chaplan et al。，1994）。。如先前建立的那样，使用Hargreaves测定法来测量热敏感性（Hargreaves等人，1988年；杰克逊等人，1995年； Barabas和Stucky，2013年； Cowie等。 > et al。，2018年）。对玻璃平台下方聚焦辐射热源（IITC，生命科学仪器）的撤回潜伏期进行了3次测量，并对每只小鼠取平均值。截止时间为20 s，以避免受伤。切口后的机械和热超敏反应示例如图10所示。

图9. von Frey单丝的应用。在切口后将橙色的von Frey单丝应用于最敏感的位置。

图10.切口后的机械和热阈值。 A。切口后将von Frey单丝应用于最敏感的部位，并使用Dixon上下法（Dixon，1980）确定机械阈值。B. Hargreaves测定法（Hargreaves等人，1988年）用于测量切开后响应于辐射热源的辐射热源的撤离阈值。这些数据是从Cowie等人（2018）修改而来的。数据显示为平均值±SEM，重复测量的两次方差分析和Sidak事后分析，** > P ＆lt; 0.01和**** > P ＆lt; 假手术vs切开手术0.0001 对于（A）和（B），每组n = 8只雄性小鼠。

致谢

该协议改编自已公开的程序（Brennan等，1996； Pogatzki和Raja，2003）。这项工作得到了美国国家神经疾病研究所的支持，中风授予了CLS NS040538和NS070711，授予AMC授予了F31GM123778。威斯康星医学院的“提高健康的威斯康星基金会”的研究和教育部分提供了部分支持。作者感谢Timothy J Brennan博士对手稿的审阅。

利益争夺

作者声明没有任何竞争性的金融或非金融利益。

伦理

所有动物程序均按照美国国立卫生研究院的指导原则进行，并由威斯康星州医学院的机构动物护理和使用委员会（AUA＃0383）批准。

参考文献

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