材料和试剂

1.5 ml MaxyClear Microtubes（Axygen，目录号：MCT-150-C）
0.2 ml聚丙烯PCR管（Axygen，目录号：PCR-0208-C）
移液器吸头（Corning，Axygen ®）
0.22μmMillipore过滤器（Millipore，目录号：R7MA69670）
飞行种群（所有 Drosophila 菌株存放在清华飞行中心）
1. Y，V; attp40 {nos-Cas9} （TH00788）
2. Y， v ;; attp2 {nos-Cas9} （TH00787）
3. y sc v （TB00077）
4. y sc v; Gla Bc / CyO （TB00023）
5. y sc v ;;博士，e / TM3，Sb （TB00139）
Trans5α化学感受态细胞（Transgen Biotech，目录号：CD201-01）
PCR引物（表1），定制合成＆nbsp;

表1.用于菌落PCR和DNA测序的引物
pU6B（氨苄青霉素抗性，图1）

图1. pU6B的构建图。两个BbsI位点之间的插入片段是检测sgRNA是否与载体连接的标记。 U6Bp-FS1和V20-R是用于菌落PCR和DNA测序的引物。
BbsI（New England Biolabs，目录号：R0539L）
GoTag Green Master Mix，2x（Promega，目录号：000179370）＆nbsp;
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202L）
AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（Corning，Axygen ®，目录号：AP-MN-P-250）
AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（Corning，Axygen ®，目录号：AP-GX-250）
PurePlasmid Mini Kit（CWBiotech，目录号：CW0500M）
结合缓冲液PB（QIAGEN，目录号：154051779）
苯酚 - 氯仿（Solarbio，目录号：P1012）
绝对乙醇（Sigma，目录号：SHBC3572V）
异丙醇（Sigma，目录号：SZBC2260V）
醋酸钠（Amrosco，目录号：1123C206）
10x PBS（双螺旋，目录号：S0905A）
50x TAE（双螺旋，目录号：P0309A）
琼脂糖（Invitrogen，目录号：0000602315）
LB粉末（BD，目录号：2171199）
KCl（AMRESCO，目录号：7447-40-7）
Tris-HCl（AMRESCO，目录号：1185-53-1）
EDTA（AMRESCO，目录号：60-00-4）
NaCl（AMRESCO，目录号：7647-14-5）
SDS（Beyotime，目录号：ST628）
蛋白酶K（罗氏，目录号：P8601-100）
氨苄青霉素（Solarbio，目录号：A8180）
溴化乙锭（Sigma，目录号：E8751）
0.2 M磷酸钠缓冲液储备液（pH 6.8）（参见配方）
0.2 M Na 2 HPO 4 储备液（参见配方）
0.2 M NaH 2 PO 4 储备液（参见配方）
10x注射缓冲液（见食谱）
10x退火缓冲液（见食谱）
1x PBS（见食谱）
LB（Luria Bertani）中等（见食谱）
1x TAE（见食谱）
裂解缓冲液（见食谱）
1.5％琼脂糖凝胶（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf）
微波炉（三洋，型号：EM-2509EB1）
高压灭菌器（三洋，型号：MLS-3780）
PCR热循环仪（Eppendorf，Mastercycler nexus GSX1）
冷藏离心机（Eppendorf，型号：5417R）
DNA电泳仪（Bio-Rad）
显微镜（奥林巴斯，型号：SZX10）
NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific）
孵化器（GINGKO）
4°C冰箱（海尔）
-20°C冰柜（海尔）

程序

构建表达靶向目的基因的sgRNA的质粒（参见图2，以获得CRISPR质粒构建的概述）

图2. CRISPR质粒构建的示意图。靶向 wh ite 的sgRNA与BbsI消化的pU6B质粒连接。
1. 用限制性内切酶BbsI-HF消化质粒U6B-短导RNA-MG（pU6B）（图1）
  1. pU6B是由指导sgRNA转录的U6b调节序列组成的构建体。设置50μl限制性消化反应：
  2. 将反应在37℃孵育1.5小时，然后用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒1.5％琼脂糖凝胶提取3.5kb条带。＆nbsp;
  3. 用50μlddH 2 O洗脱产物（最终浓度应为约50 ng /μl）。
2. 制备靶向目的基因的20nt sgRNA
  1. 可以选择靶基因外显子中NGG上游20nt作为20nt sgRNA。此外，该网站（ https://www.flyrnai.org/crispr ）可以帮助您选择适当的sgRNA序列。在指定区块中输入基因ID，符号或染色体位置并单击提交按钮后，可以选择一系列由绿点标记的sgRNA序列。根据效率，移码和seedScore，可以获得最佳序列。先前的研究表明，在距离PAM最近的6个核苷酸中具有3个或更少GCs的sgRNA很少达到60％的可遗传突变率，但在该区域中具有至少4个GC的sgRNA几乎总是具有超过60％的可遗传突变率（Ren et al。。，2014）。
    注意：最好选择接近靶基因5'末端或位于基本功能域的sgRNA。此外，如果在20nt sgRNA序列中发现限制性位点，则很可能被CRISPR-Cas9介导的遗传性突变破坏，为筛选突变体后代提供了便利的方法。
  2. 应设计两个具有20nt sgRNA序列的互补24nt引物，以产生双链DNA，其两端具有4bp适当的突出端，并克隆到BbsI消化的pU6B中。正向引物由5'插入TTCG和随后对靶基因特异的20nt sgRNA序列组成，而反向引物由5'插入AAAC和20nt反向互补序列组成。
  3. DNA退火的准备：
  4. 在热循环仪中在95°C下变性5分钟，然后停止加热并使其缓慢冷却至室温。
3. 结扎
  在室温下孵育反应半小时，根据标准转染程序用5μl连接产物转化10μlTrans5α化学感受态细胞（转基因），然后在具有100μg/ ml氨苄青霉素选择的LB固体培养基上平板。将板在37°C倒置孵育过夜。＆nbsp;
4. 通过PCR选择正确的克隆并通过DNA测序验证插入＆nbsp;
  1. 用引物U6Bp-FS1和引物V20-R进行菌落PCR。用20μl尖端标记并挑取菌落到10μlPCR反应混合物中：＆nbsp;
    
    热循环条件是：
  2. 正确的克隆将产生约300bp的PCR产物，而没有条带或大约1kb的条带是不正确的。然后将正确的克隆接种到液体LB培养物中，并按照标准程序用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit提取质粒。使用引物U6Bp-FS1通过Sanger测序确认正确插入。＆nbsp;
质粒pU6B-sgRNA纯化和注射
1. 将结合缓冲液PB，异丙醇和乙酸钠加入10mg质粒pU6B-sgRNA DNA中并倒置以彻底混合。将混合物转移至mini prep柱以纯化质粒。用1x注射缓冲液洗脱色谱柱。将最终浓度调整至约75 ng /μl（Ren et al。，2014）。
  注意：在注射前，我们建议将溶解在1x注射缓冲液中的纯化质粒DNA在4℃，12,000 xg 离心20分钟以上不溶物质沉淀。
2. 将1x注射缓冲液（~75ng /μl）中的质粒注射到1小时内收集的转基因Cas9果蝇的胚胎中。显微注射遵循（Ni et al。，2011）中描述的标准程序。注射的胚胎应保持在25°C和60％湿度至成年期（G0）。
  注意：转基因Cas9果蝇是通过将nos-Cas9质粒（Ren 等，2013）整合到第二染色体或attP2着陆的attP40着陆点而创建的。通过phiC31整合酶在第三染色体上的位点，然后筛选存在于nos-Cas9质粒中的朱红色+标记。如果我们想要改变第三条染色体上的基因，我们应该选择TH00788（y，v; attp40 {nos-Cas9}）进行显微注射，而第二条染色体上的基因选择TH00787（y，v ;; attp2 {nos -Cas9}）。此外，可以选择TH00788和TH00787进行显微注射以突变X或第四染色体上的基因。请注意，nos-Cas9和靶基因应在不同的染色体上表达，以便在下一步将染色体与Cas9分开。
筛选突变（筛选程序概述见图3）

图3.在2 nd 染色体上筛选CRISPR / Cas9诱导突变的程序概述 < br />
1. 首先将所有G0成年果蝇分别从注射的胚胎中与TB00077孵化，以增加后代的数量。
2. 将每个F1后代与携带适当平衡器的苍蝇交叉（例如，对于染色体II目标，使用 y sc v; Gla Bc / CyO 或类似物），使后代具有染色体突变更稳定。产卵后，挑选单个F1并提取基因组DNA，通过苯酚 - 氯仿提取PCR扩增目标基因座。
  1. 在400μl裂解缓冲液中均质化每一个。将裂解液在55°C孵育1小时，然后用400μl苯酚 - 氯仿提取。＆nbsp;
  2. 在4℃下将混合物在12,000 x g 离心20分钟。然后将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇和10μl乙酸钠。＆nbsp;
  3. 将充分混合的液体在-20℃下保持至少1小时，然后在4℃以12,000 离心20分钟离心20分钟。用移液管除去上清液，用500μl75％乙醇洗涤沉淀，然后在4℃以12,000 离心20分钟离心20分钟。
  4. 最后，将沉淀溶解在30μlddH 2 O中。
  5. 设计基因特异性引物以扩增目标基因座周围的区域，并确保引物的GC含量约为60％，以便它们可以在55°C退火。使用0.6μl基因组DNA提取物作为模板，使用以下反应系统通过PCR扩增目标基因座周围的DNA序列35个循环：
  6. 通过对PCR扩增产物进行测序进一步确认诱变事件。
  注意：如上所述，如果限制性位点恰好嵌入选定的sgRNA序列中，则该位点可能会发生变异。我们可以首先用相应的内切核酸酶消化靶基因座周围的基因组DNA的PCR扩增产物。如果它不能被切割，这部分目标基因很可能被破坏，为这里的筛选提供了一种便捷的方式。
3. 然后筛选F2后代的黄色 - 以将染色体与 nos -Cas9分开。＆nbsp;
4. 现在，一半的F2后代携带一组诱变的染色体，因此可以通过将雄性单独交配到几个处女雌性来测试突变的存在。产卵后，我们挑选一个F2并提取基因组DNA，通过苯酚 - 氯仿提取PCR扩增目标基因座。如步骤C2所述，通过酶消化或DNA测序进一步鉴定我们想要的突变体。
  注意：由于雌性果蝇易于进行同源重组以修复突变体染色体，我们建议使用雄性果蝇进行交配。
5. 最后，F3果蝇与相同的突变结果单独杂交，纯合子突变体将在后代产生。如果纯合蝇不健康或致命，则将突变体系保持为平衡杂合子。

数据分析

从各个F1和F2蝇的基因组DNA扩增的PCR产物将通过DNA测序确认。通过重叠的双峰检测突变序列而不是野生型序列。 F3中的纯合子代仅具有突变的gDNA序列的单峰。

食谱

10x注射缓冲液
1 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.8）
50 mM KCl
准备无菌蒸馏水，并通过0.22μmMillipore过滤器过滤
储存在-20°C
0.2 M磷酸钠缓冲液（pH 6.8）（原液）
51毫升0.2M NaH 2 PO 4
49ml 0.2M Na 2 HPO 4
在室温下储存
0.2M Na 2 HPO 4 （储备溶液）
在1L ddH 2 O中溶解71.6g Na 2 HPO 4 •12H 2 O，充分混合< br /> 在室温下储存
0.2M NaH 2 PO 4 （储备溶液）
在1L ddH 2 O中溶解31.2g Na 2 HPO 4 •2H 2 O，充分混合< br /> 在室温下储存
10x退火缓冲液
100mM Tris-HCl（pH 7.5）
10 mM EDTA
1 M NaCl
在室温下储存
1x PBS
100毫升10倍PBS
900毫升ddH 2 O
在室温下储存
LB（Luria Bertani）中等
将25g LB粉末溶解在1L ddH 2 O中，充分混合
在121℃下高压灭菌15分钟
1x TAE
20毫升50倍TAE
980 ml ddH 2 O
在室温下储存
裂解缓冲液
50毫升1x PBS
0.2％SDS
200μg/ ml蛋白酶K
储存在4°C
1.5％琼脂糖凝胶
1.5克琼脂糖
100毫升1x TAE
加热溶液以在微波炉中溶解琼脂糖
加入溴化乙锭至终浓度为0.2μg/ ml

致谢

这项工作得到NIH Grants R01GM084947和R24OD021997以及美国国立卫生研究院通用医学科学部NIH的Ruth L. Kirschstein国家研究服务奖F32GM113395的支持。这项工作得到了中华人民共和国科学技术部国家重点技术研究发展计划（2015BAI09B03,2016YFE0113700）和国家自然科学基金（31571320）的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

参考

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Ni，JQ，Zhou，R.，Czech，B.，Liu，LP，Holderbaum，L.，Yang-Zhou，D.，Shim，HS，Tao，R.，Handler，D.，Karpowicz，P.，Binari ，R.，Booker，M.，Brennecke，J.，Perkins，LA，Hannon，GJ和Perrimon，N。（2011）。在果蝇中转基因RNAi的基因组规模shRNA资源。 Nat方法 8（5）：405-407。
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