第一部分：荧光非经典氨基酸标记（FUNCAT） - 协议

该方法描述了幼体体壁的制备，其包括各种组织和细胞类型，包括体壁和气管上皮，感觉神经元，运动神经元，外周神经胶质和肌肉。可以附加其他组织，例如CNS，成像盘或唾液腺。

材料和试剂

钨针
碟
磁箔
不锈钢销
1.5毫升Eppendorf管
巴斯德吸管（Carl Roth，目录号：4518.1）
48孔板（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3548）
显微镜载玻片（Carl Roth，目录号：H868.1）
盖玻片（Carl Roth，目录号：H874.2）
解剖板：用于解剖和固定幼体体壁的蜡板（自制，或PDMS或磁板）
Erdmann et al。（2015）中描述的 Drosophila 菌株
超纯水（Carl Roth，目录号：AE72）
二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
将1mM四甲基罗丹明 - （TAMRA）炔烃标记物（Thermo Fisher Scientific，目录号：T10183）在DMSO中以10μl等分试样，在-20°C下储存长达1年，避免反复冻融
200mM三唑配体（TBTA;三[（1-苄基-1 H -1,2,3-三唑-4-基）甲基]胺）（Sigma-Aldrich，目录号：678937）在DMSO中以10μl等分试样，在-20°C下储存长达1年，避免反复冻融
超纯水中400mM TCEP（三（2-羧乙基）膦盐酸盐）（Sigma-Aldrich，目录号：C4706）（使用前新鲜制备）
超纯水中的200 mM CuSO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：1027900250）（使用前新鲜制备）
VectaShield TM 安装介质（Fisher Scientific，目录号：13273694）
透明指甲油（药店）
NaCl（Carl Roth，目录号：3957）
KCl（Carl Roth，目录号：6781）
MgCl 2 •6H 2 O（Carl Roth，目录号：2189）
NaHCO 3 （Carl Roth，目录号：8551）
蔗糖（Carl Roth，目录号：4621）
海藻糖（Carl Roth，目录号：5151）
HEPES（Carl Roth，目录号：9105）
CaCl 2 （Carl Roth，目录号：T885）
Na 2 HPO 4 （Carl Roth，目录号：X987）
NaH 2 PO 4 （Carl Roth，目录号：T879）
PFA（Carl Roth，目录号：0335）
KH 2 HPO 4 （Carl Roth，德国，目录号：3904）
NaOH（Carl Roth，目录号：6771）
HCl（Carl Roth，德国，目录号：9277）
20％Triton ® X-100（Carl Roth，目录号：3051）
Tween ® -20（Carl Roth，目录号：9127）
血淋巴样溶液，HL3（见食谱）
4％多聚甲醛（PFA），（见食谱）
磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.2（见食谱）
1x PBS pH 7.4或7.8（参见食谱）
PBT（见食谱）
PBS-Tw（见食谱）
不含EDTA的50x蛋白酶抑制剂（PI）（参见食谱）
均质缓冲液（见食谱）
20％（w / v）SDS（见食谱）
PBS-SDS pH 7.8（见食谱）
PBS-Igepal-630（见食谱）
2x SDS洗脱缓冲液（见食谱）

设备

双目（例如，徕卡，型号：MZ10F）
镊子（精细科学工具，目录号：11255-20）
剪刀（精细科学工具，目录号：15002-08）
往复振动器（例如，GFL，型号3006）
涡旋混合器（例如，科学工业，型号：Vortex-Genie 1或2）
4°C冰箱
-20°C冰柜

程序

需要特异性表达dMetRS L262G 细胞类型并且喂食非经典氨基酸叠氮亮氨酸（ANL）的幼虫。可以获得关于在果蝇中使用叠氮亮氨酸的蛋白质的细胞类型特异性代谢标记的详细方案（Erdmann 等人，，2017）。

根据Brent 等人（2009）或Ramachandran和Budnik（2010）先前报道的程序解剖幼虫体壁。这里提供了幼虫体壁解剖的详细视频（视频1）。图1显示了幼虫身体解剖的必要材料和工具。简而言之，使用位于解剖板上的前端和后端的短距离（~0.2mm）处的针固定并轻轻地将漂洗过的和仍然湿润的幼虫背侧朝上拉伸。用HL3溶液覆盖动物（参见食谱）。将剪刀片垂直固定并适度压在幼虫角质层上，离后端约0.5至1毫米，产生一个单一切口的孔。从该位置开始，现在将叶片保持在水平方向，将幼虫沿其背中线切割成两个针中的任一个。从而避免剪刀的下（内）刀片刮擦腹侧体壁。在两端向右和向左做短路。推动一端使得拉伸被释放并且诸如肠和脂肪体的内部器官被挤出。使用镊子，去除与进一步分析无关的器官。使用额外的针头展开并对称地跨越体壁（即，使体壁变平），避免过度拉伸。

视频1.幼虫体壁解剖3倍延时。将湿幼虫放在补充图中所示的解剖室上。使用中央直的夹子，动物被固定并适度伸展，背侧向上。然后用不含Ca 2+ +的盐水覆盖动物。使用弹簧剪刀以约75％的长度挤压一个孔，作为沿背中线，第一方向嘴钩然后朝向后端切割的起始点。在任一端向右和向左做短切口。为了避免刮伤体壁肌肉并用刀片伤害幼虫大脑，剪刀在切割过程中会略微抬起。一旦切开，幼虫被推动一点以挤出内脏器官，如肠道和脂肪体，从而减轻它们的移除。然后使用侧夹将小心翼翼地跨越体壁。

图1.用于幼体体壁切割的材料和工具。包括Ca 2 + - 免费盐水，含有自来水或含盐水的培养皿，用于在解剖前冲洗幼虫，精镊（例如，Dumont＃5）和弹簧剪（例如，Vannas-type，FST 15002-08）。作为PDMS板与尖锐钨针的广泛使用组合的替代方案，可以在基于具有中心孔的磁性箔的腔室（~5×8cm 2 ）上进行解剖。直径约2厘米，粘在1至2毫米厚的玻璃载玻片上。不锈钢销钉粘在铁基支架上，并带有尖锐的钩状末端，用作活动夹。
通过用巴斯德吸管加入2-3滴4％PFA（参见食谱），将预制的体壁预固定约30秒。避免将溶液直接滴在体壁部分，以防止癫痫样收缩; 1到2厘米的距离很好。
取出HL3-PFA溶液并用4％PFA替换，将板转移到潮湿和黑暗的盒子中并固定20分钟。在固定期间和所有后续步骤中，保持样品避光，例如，在黑暗和潮湿的盒子中，盖子关闭以避免固定剂和随后的溶液蒸发并保护EGFP荧光不褪色。所有洗涤步骤均在室温（RT）下在往复振荡器（每分钟25转）的温和搅拌下进行。
用PBT（见食谱）洗涤体壁三次，每次15分钟。
用1x PBS pH 7.8（参见食谱）洗涤体壁三次，每次15分钟。＆nbsp;
将固定的体壁置于48孔板中的200μl1xPBS pH 7.8中;将48孔板置于黑暗潮湿的盒子中，盖子关闭，直到FUNCAT反应混合物（见下一步）在室温下准备好（约5分钟）。＆nbsp;
在室温下在1.5 ml反应管中制备FUNCAT试剂：至1 ml 1x PBS pH 7.8添加：
1. 1μl200mM三唑配体（终浓度200μM）。
2. 0.2μl1mMTAMRA-炔烃标签（终浓度0.2μM）。
3. 1μl400mMTCEP溶液（终浓度400μM）。
4. 每次添加步骤后，使用涡旋混合器以尽可能高的速度剧烈混合10秒;我们在2,700转/分时获得最佳结果。
5. 继续加入1μl200mMCuSO 4 （终浓度200μM）。
6. 使用涡旋混合器以最高速度（2,700rpm）混合30秒。
7. 在室温下保持FUNCAT反应混合物准备好直至使用;快速继续第8步。
从48孔板的体壁中取出1x PBS pH 7.8后，立即在体壁上涂上200μlFUNCAT试剂。
在往复式振荡器上在温和搅拌下于4℃孵育过夜。
取出FUNCAT试剂并用200μlPBS-Tw（参见配方）洗涤体壁三次，每次15分钟。
用200μlPBT洗涤体壁三次，每次15分钟。
对于与抗体的共染色，遵循标准方案。这种类型的制备通常不需要阻塞步骤。简言之，将PBT中的一级抗体稀释至适当浓度，并在4℃下将样品孵育过夜或在室温下孵育1小时。在用200μlPBT洗涤三次15分钟后，各自在PBT中施加荧光标记的二抗，通常浓度为1：300（例如，如果从Jackson Laboratories购买），并在4℃下孵育样品过夜或在1℃下孵育1小时。室内温度。请注意，红色荧光染料如Cy3或Alexa 568在这里没有用，因为它们的激发和发射光谱很大程度上与TAMRA重叠。＆nbsp;
在显微镜载玻片上安排体壁;用几滴VectaShield TM 安装介质安装它们，然后轻轻地将盖玻片放在体壁上。
用一层薄薄的透明指甲油密封盖玻片的边缘。
将载玻片保存在4°C直至成像，并在-20°C下长期保存。图2中提供了 de novo 合成胶质蛋白FUNCAT染色的实例。

图2.通过FUNCAT对神经胶质蛋白进行细胞类型特异性原位标记。通过FUNCAT监测幼虫蛋白中的ANL掺入dMetRS L262G的靶向表达 -EGFP在胶质细胞中（ r epo-Gal4 / UAS-dMetRS L262G -EG FP ）在幼虫神经肌肉接头处（肌肉6/7，段A2）。与神经元特异性标志物抗HRP的共染色显示，无论运动神经元（m）和神经胶质突起（g）的神经末梢b（b）紧密接触，ANL-TAMRA信号确实限于dMetRS L262G -EGFP表达神经胶质细胞。值得注意的是，dMetRS L262G -EGFP主要存在于细胞质中，而含有TAMRA的蛋白质在整个神经胶质细胞中被检测到，包括核（n）和神经胶质突起（g）紧邻第一突触boutons 。比例尺为5μm。

第二部分：生物正交非经典氨基酸标记（BONCAT） - 协议

材料和试剂

注射器
Zeba Desalt Spin Columns（Thermo Scientific，目录号：10627354）
解剖板：用于解剖和固定幼体体壁的蜡板（自制，或PDMS或磁板）
1.5毫升管（例如，Eppendorf，目录号：0030120086）
15毫升离心管（例如，Greiner bio-one，目录号：188261）
果蝇
液氮
CO <子> 2
超纯水（Carl Roth，目录号：AE72）
Benzonase ®核酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：E1014）
在10x等分试样中，在1x PBS pH 7.8（根据Link和Tirrell，[2003]合成）中的25mM生物素-PEO 3 - 炔烃标签，在-20℃下储存长达1年，避免反复冻融
铜（I）溴化物（Acros Organics，目录号：199582500）
200μl三唑配体（TBTA;三[（1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基）甲基]胺）（Sigma-Aldrich，目录号：678937），在DMSO中，10μl等分试样，储存在-20°C下长达1年，避免反复冻融
NeutrAvidin TM 琼脂糖（Thermo Scientific，目录号：29204）
NaCl（Carl Roth，目录号：3957）
KCl（Carl Roth，目录号：6781）
MgCl 2 •6H 2 O（Carl Roth，目录号：2189）
NaHCO 3 （Carl Roth，目录号：8551）
蔗糖（Carl Roth，目录号：4621）
海藻糖（Carl Roth，目录号：5151）
HEPES（Carl Roth，目录号：9105）
CaCl 2 （Carl Roth，目录号：T885）
罗氏完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Sigma-Aldrich，目录号：04693132001）
SDS（Carl Roth，目录号：2326.3）
Igepal-630（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
Tris，pH 6.8（SERVA，目录号：37180）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：63689）
甘油（Carl Roth，目录号：3783）
溴酚蓝（Carl Roth，目录号：A512）
20％Triton ® X-100（Carl Roth，目录号：3051）
硝酸纤维素膜（例如，ProtranBA85,0.45μm，Whatman）
血淋巴样溶液，HL3（见食谱）
不含EDTA的50x蛋白酶抑制剂（PI）（参见食谱）
均质缓冲液（见食谱）
20％（w / v）SDS（见食谱）
PBS-SDS pH 7.8（见食谱）
PBS-Igepal-630（见食谱）
2x SDS洗脱缓冲液（见食谱）

设备

吸管
双目（例如，徕卡，型号：MZ10F）
镊子（精细科学工具，目录号：11255-20）
剪刀（精细科学工具，目录号：15002-08）
玻璃均质器（Wheaton，via Fisher Scientific，目录号：10449651）
旋转器/末端混合器（例如，neoLab，目录号：2-1175）
小型离心机（例如，neoLab，型号：Spectrafuge 3-1810）
微型离心机（例如，Eppendorf，型号：5424）
涡旋混合器（例如，Scientific Industries Inc.，型号：Vortex-Genie 2）
加热块（例如，VWR，目录号：12621-100）
离心机（Eppendorf，目录号：5810R）
Hoefer Mighty小型系统SE250（Amersham Biosciences）
-20°C冰柜
-80°C冰柜

程序

材料的准备
建立该方案用于裂解8个幼虫体壁，50个幼虫脑或20个飞行头至最终体积500μl。需要特异性表达dMetRS L262G 细胞类型并且用非经典氨基酸叠氮亮氨酸（ANL）喂养的幼虫或果蝇，以使其能够掺入蛋白质中。关于果蝇中ANL的蛋白质细胞类型特异性代谢标记的详细方案可用（Erdmann et al。，2017）。
1. 幼体体壁的制备
  1. 根据Brent 等人（2009）或Ramachandran和Budnik（2010）先前报道的程序，如上文第I部分的程序中所述，在HL3溶液中制备幼体体壁（参见配方）。但是，跳过FUNCAT和免疫染色所需的最终压扁（第I部分程序中的步骤1）。＆nbsp;
  2. 切开最前部和后部以从体壁移除口钩和后部气门。
  3. 用镊子取出剩余的体壁，小心擦拭组织，除去多余的HL3溶液。
  4. 将体壁直接转移到含有50μl均质缓冲液（参见食谱）的玻璃匀浆器中，并在冰上重复解剖，直至收集每组8个体壁。或者，可以在稍后的时间点处理幼体体壁。为此，在冰上1.5 ml管中的50μl匀浆缓冲液中收集8个体壁，在液氮中冲击冷冻并储存在-80°C直至进一步处理。继续，在进行步骤B之前，将冰冻样品解冻。
2. 幼虫大脑的制备
  1. 通过打开 Drosophila 幼虫的背部位点在HL3溶液中制备幼虫大脑，并使用镊子从头部移除大脑。
  2. 在组织上仔细擦拭幼虫脑以除去过量的HL3溶液，并将其转移到玻璃匀浆器中，在冰上用50μl匀浆缓冲液重复解剖，直至收集每组50个脑。或者，可以在稍后的时间点处理幼虫脑。为此，在冰上1.5 ml管中的50μl匀浆缓冲液中收集50个脑，在液氮中冲击冷冻并储存在-80°C直至进一步处理。继续，在进行步骤B之前，将冷冻样品解冻在冰上。＆nbsp;
3. 飞头的准备
  1. 用CO 2 麻醉苍蝇。
  2. 使用一把小剪刀或镊子切断20个蝇头，并将它们直接转移到含有50μl均质缓冲液的玻璃匀浆器中（见食谱），如视频2所示。图3显示了主要的解剖步骤。或者，可以在稍后的时间点处理飞行头壁。为此，将头部置于冰上1.5 ml管中的50μl匀浆缓冲液中，在液氮中冲击冷冻并储存在-80°C直至进一步处理。继续，在进行步骤B之前，将冰冻样品解冻在冰上。
    视频2.飞头解剖。首先，将含有50μl匀浆缓冲液的玻璃匀浆器置于冰上。用小瓶中的CO 2 将苍蝇麻醉几秒钟。一旦苍蝇不动，就将它们转移到PDMS解剖板上，该解剖板放置在冷板的顶部。使用一对精细的镊子握住腹部，用第二把钳子或细剪刀轻轻地夹住头部。最后，将头部直接转移到含有均化缓冲液的玻璃均化器中。继续进行，直到在均化器中收集到总共20个解剖头。
    
    图3.飞头解剖。 A.准备含有50μl匀浆缓冲液的玻璃匀浆器，将其置于冰上。 B.用CO 2 麻醉苍蝇。 C.将麻醉的苍蝇转移到PDMS解剖板上，该解剖板放置在冷板的顶部。 D.使用细镊子保持腹部和第二对镊子或细剪刀轻轻夹住/切断蝇头。 E.将头部直接转移到含有均化缓冲液的玻璃均化器中。重复步骤（图3D和3E），总共20个解剖头。
蛋白质提取
注意：如果没有另行说明，则所有后续步骤均在冰上进行。
1. 任选地（对于冷冻和储存的材料）：将解冻的样品转移到含有50μl匀浆缓冲液的玻璃匀浆器中。
2. 用均质化雌蕊均质化材料60-120秒或直至悬浮液均匀并且在冰上没有任何碎片。
3. 加入2.5μl20％SDS（参见配方）和1μlBenzonase®并再次匀浆。
4. 用微型离心机将材料旋转，以在室温下收集管底部的所有样品（约2,000 x g 5秒）。
5. 将悬浮液转移到1.5毫升管中。＆nbsp;
6. 用50μl匀浆缓冲液冲洗玻璃均化器，用微型离心机（约2,000 x g ）旋转材料5秒钟，并将悬浮液转移到步骤B5的1.5ml管中。
7. 在室温下在末端混合器中孵育悬浮液20分钟。
8. 用迷你离心机将材料旋转下来。
9. 在95℃下加热悬浮7分钟，然后在冰上冷却5分钟。
10. 将5μl20％Triton ® X-100加入悬浮液中并使用涡旋混合器短暂混合。
  注意：悬架应完全冷却;否则当添加20％Triton X-100时，蛋白质会变性。
11. 加入391.5μl匀浆缓冲液至终体积约500μl。
12. 将悬浮液孵育1小时，在4℃下在末端混合器中孵育。
13. 在4℃下以3,000 x g 离心5分钟，并将上清液（=蛋白质裂解物）转移到坐在冰上的新1.5ml管中。
点击化学
注意：该协议根据Dieterich 等（2007）进行了修改。与FUNCAT反应试剂相反，点击化学的各个组分直接添加到蛋白质裂解物中。
1. 将Cu（I）Br称入几个2ml管中，计算每管达到10mg / ml浓度所需的超纯水量。不要溶解Cu（I）Br。一种Cu（I）Br悬浮液可用于两次点击反应。
2. 向蛋白质裂解物中加入0.5μl的200mM三唑配体（终浓度200μM），并使用涡旋混合器以最高速度2,700rpm混合10秒。
3. 向蛋白质裂解物中加入0.5μl25mM生物素-PEO 3 - 炔烃标签（终浓度25μM），并使用涡旋混合器以2,700rpm的最高速度混合10秒。＆nbsp;
4. 向Cu（I）Br（10 mg / ml）中加入适量的超纯水，用涡旋混合器以最高速度2,700 rpm混合10 s。
5. 将10μl10mg / ml Cu（I）Br悬浮液（终浓度0.5 mg / ml）加入蛋白质裂解液中，使用涡旋混合器以最高速度2,700 rpm混合30秒。＆nbsp;
6. 将反应混合物在4℃下在末端混合器中孵育过夜。
7. 将反应混合物在3,000 x g 下于4°C离心5分钟。
  注意：Cu（I）Br和剩余的三唑配体会在管底部沉淀。
8. 将上清液转移到新的1.5ml管中。
脱盐
注意：所有后续步骤均在冰上执行。
1. 从脱盐柱上取下底部盖子，松开盖子，将柱子放入15 ml离心管中。
2. 在4℃下以1,000 x g 离心2分钟。
3. 在洗涤程序的每个离心步骤之后丢弃流出物。
4. 向柱中加入1ml PBS-SDS pH 7.8（参见配方）。
5. 在4℃下以1,000 x g 离心2分钟。
6. 重复步骤D4和D5两次。＆nbsp;
7. 将色谱柱放入新的15 ml离心管中，将点击的蛋白质裂解液加入色谱柱中。
8. 在4℃下以1,000 x g 离心2分钟。
9. 弃去色谱柱，向点击和脱盐的蛋白质裂解液样品中加入20μl50xPI w / o EDTA（参见配方;最终浓度2x PI w / o EDTA）。
调整蛋白质浓度
我们使用Dieterich et al。（2006）中描述的标准酰胺黑测定来确定样品的蛋白质浓度，并将所有样品的浓度调整到具有最低值的样品重复的浓度。用PBS-SDS测定蛋白质的量为pH 7.8 + 2x PI。这种调节改善了后续电泳的质量。我们用标准银凝胶染色控制调整。其他测量含有洗涤剂的蛋白质样品的方法和随后的调整也是合适的。
NeutrAvidin净化
适量的NeutrAvidin TM 琼脂糖取决于样品中ANL标记蛋白的浓度。如果您在加工样品的未结合部分观察到强烈的生物素信号，则相应地增加NeutrAvidin TM 琼脂糖的量。作为起点，您可以使用100μlNeutrAvidin TM 琼脂糖悬浮液用于来自泛神经元驱动系的ANL标记的蛋白质和150μl用于ANL标记的神经胶质或肌肉蛋白的悬浮液。＆nbsp;
1. 轻轻搅拌NeutrAvidin TM 琼脂糖悬浮液数次，直至底部的珠子在储存缓冲液中均匀混合。
2. 使用裁剪的移液管尖端将适量的NeutrAvidin TM 琼脂糖悬浮液转移到1.5ml管中。
3. 平衡NeutrAvidin TM 琼脂糖
  1. 加入1 ml PBS-Igepal-630（参见食谱）并将管倒置数次。
  2. 在4℃下以3,000 x g 离心5分钟。
  3. 用移液管或注射器小心丢弃上清液。
  4. 重复步骤F3a-F3c两次。
4. 同时将脱盐的，点击的蛋白质裂解物与Igepal-630（样品中的最终Igepal-630浓度：1％）在4℃下在末端混合器中孵育至少20分钟。
5. 将20-40μl蛋白质裂解液转移至新的1.5 ml管（=输入级分）进行SDS-PAGE和Western印迹分析，按照实验室的要求制备样品进行SDS-PAGE，并将样品冷冻至-20° C.＆NBSP;
6. 将蛋白质裂解物加入到平衡的NeutrAvidin TM 琼脂糖中，并将混合物在4℃下在端部混合器中孵育过夜。
7. 在4℃下以3,000 x g 离心5分钟。
8. 将上清液转移到1.5ml管（=未结合的部分）中。对于SDS-PAGE和Western印迹分析，将20-40μl转移到新的1.5 ml管中，并根据实验室的惯例准备样品用于SDS-PAGE。在-20°C下冷冻样品。
9. 洗涤NeutrAvidin TM 琼脂糖
  1. 加入1 ml PBS-Igepal-630。
  2. 在室温下在端部混合器中孵育NeutrAvidin TM 琼脂糖5分钟。
  3. 在4℃下以3,000 x g 离心5分钟。
  4. 丢弃上清液。
  5. 再重复步骤F9a-F9d 4次。
  6. 向NeutrAvidin TM 琼脂糖中加入1ml 1x PBS pH 7.8。
  7. 在室温下在端部混合器中孵育NeutrAvidin TM 琼脂糖5分钟。
  8. 在4℃下以3,000 x g 离心5分钟。
  9. 丢弃上清液。
  10. 重复步骤F9f-F9i两次。
10. ANL标记的生物素标记蛋白的洗脱
  1. 将2x SDS洗脱缓冲液（参见配方）加入含有洗过的NeutrAvidin TM 琼脂糖的试管中。
    经验法则：洗脱缓冲液的体积应为NeutrAvidin TM 琼脂糖悬浮液体积的1/2（即，当你使用100μlNeutrAvidin TM 琼脂糖悬浮液，使用50μl洗脱缓冲液。
  2. 将样品在95°C加热7分钟。
  3. 将样品在冰上冷却5分钟。
  4. 在4℃下以3,000 x g 离心5分钟。
  5. 将上清液转移到新的1.5ml管（=洗脱液部分）中。
SDS-PAGE和Western blot
使用标准方案进行SDS-PAGE和Western印迹。我们在Hoefer Mighty Small System SE250（Amersham Biosciences）中使用5-20％PAA，Tris-甘氨酸梯度凝胶，每个凝胶具有10mA的恒定电流。一旦溴酚蓝色前沿离开分离凝胶，就停止分离蛋白质。随后将蛋白质在200mA下转移到硝酸纤维素膜（例如，ProtranBA85,0.45μm，Whatman）上1.5小时。为了检测ANL标记的和生物素标记的蛋白质，使用抗生物素抗体（例如，兔 - 抗 - 生物素抗体，Bethyl Laboratories，目录号：A150-109A）。对于细胞类型特异性候选蛋白的检测，使用特异性抗体，例如抗Dlg抗体（DSHB，USA，抗体ID 4F3抗大片）用于检测肌肉ANL标记后的支架蛋白Discs Large，an anti -Draper抗体（DSHB，USA，抗体ID Draper 8A1）用于检测神经胶质细胞吞噬受体Draper神经胶质细胞特异性ANL标记或抗突触蛋白抗体（DSHB，USA，抗体ID 3C11 [抗SYNORF1]）神经元ANL标记后检测突触蛋白。图4显示了一个样本蛋白质印迹，描绘了生物素化的携带ANL的蛋白质以及神经元中 de novo 合成的突触蛋白。

图4.慢性ANL掺入神经元蛋白和生物正交非经典氨基酸标记（BONCAT）后的蛋白质印迹蛋白可视化和鉴定。成年果蝇的头部（a）长期暴露于ANL和（ b）泛神经元表达dMetRS L262G （ elav C155 -Gal4，UAS-dMetRS L262G -EGFP ，参见我们关于果蝇中叠氮亮氨酸蛋白的细胞类型特异性代谢标记的详细生物方案 [Erdmann et al。，2017]）被裂解（参见'蛋白质提取'，第II部分B），将蛋白质中掺入的ANL点击到生物素标签上（参见'点击'化学'，第二部分C）和脱盐（参见'脱盐'，第二部分D）。在NeutrAvidin纯化（第II部分F）之前，将蛋白质浓度标准化（参见'调节蛋白质浓度'，第II部分E）。代表性的Western印迹显示输入部分（NeutrAvidin纯化前的裂解物），未结合的部分（不含ANL的蛋白质）和全球蛋白质水平的洗脱部分（NeutrAvidin纯化后富集的ANL标记的蛋白质）（抗生物素抗体））和选择的候选神经元蛋白（抗突触蛋白抗体）。输入部分包含所有蛋白质，即生物素化和非生物素化蛋白质。因此，与NeutrAvidin纯化后的相同样品（洗脱物级分）相比，来自暴露于ANL的果蝇的样品的生物素信号被稀释至约1:10，这取决于相应的蛋白质。注意，在未暴露于ANL的果蝇的样品中未观察到生物素信号，证明了纯化步骤的适当信噪比。类似地，未结合的部分中未观察到生物素信号，证明了适当量的NeutrAvidin TM 琼脂糖。未结合部分中相对高的突触蛋白信号显示并非所有突触蛋白都是生物素化的，因此并非所有突触蛋白都包含ANL。这一结果可以通过我们技术的相对非侵入性来解释，因为内源性MetRS没有被敲除并且将甲硫氨酸加载到Met-tRNA上，从而将蛋氨酸加载到核糖体上的延长多肽链中。

数据分析

有关图像处理和数据分析，请参阅Erdmann et al。（2015）。

食谱

血淋巴样溶液，HL3
70 mM NaCl
5 mM KCl
20mM MgCl 2 •6H 2 O
10 mM NaHCO 3
115 mM蔗糖
5 mM海藻糖
5 mM HEPES
0.1 mM CaCl 2
将溶液保持在-20°C下长达6个月
4％多聚甲醛（PFA）
每100ml 1x磷酸盐缓冲液（PB）pH 7.2的4g PFA
在60°C溶解，将等分试样保持在-20°C最多3个月
磷酸盐缓冲液（PB）pH 7.2
（A）0.1M Na 2 HPO 4 ，pH 8.8
（B）0.1M NaH 2 PO 4 ，pH 4.1
将溶液B加入溶液A直至pH 7.2，在室温下保持最多3个月
1x PBS pH 7.4或7.8
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
4.3 mM Na 2 HPO 4
1.4 mM KH 2 HPO 4
用NaOH和HCl调节至pH7.4或7.8，在室温下保持1周
PBT
在1x PB pH 7.2中0.2％Triton ® X-100，在室温下保存长达1周
PBS-Tw
1x（v / v）Tween ® -20在1x PBS pH 7.4中，在室温下保存长达1周＆nbsp;
50x蛋白酶抑制剂（PI）不含EDTA
一个'罗氏完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒'片剂，加入1毫升超纯水中，在-20°C下储存长达6个月＆nbsp;
均质缓冲区
1x PBS pH 7.8
来自50x PI库存解决方案的2x PI
将缓冲液保持在冰上，准备新鲜
20％（w / v）SDS
在60°C下将2.5 L ddH 2 O加入到500 g SDS中，搅拌直至溶解，等分并在室温下储存长达6个月
PBS-SDS，pH 7.8
0.05％SDS
1x PBS pH 7.8，在室温下保存长达1周
PBS-Igepal-630
1％Igepal-630
1x PBS，pH 7.8，在室温下保持长达1周
2x SDS洗脱缓冲液
125 mM Tris，pH 6.8
10％β-巯基乙醇
2％SDS
20％甘油
0.002％溴酚蓝，在室温下保存长达3个月

致谢

这项工作得到了德国研究基金会（DFG）的支持，获得了艾美奖Noether计划拨款，DIP拨款和SFB 779拨款给D.C.D.，SFB 854拨款给联合国。和D.C.D.，Leibniz Society PAKT拨款（LGS SynaptoGenetics）给D.C.D.和U.T.，和K.M.由CBBS博士后网络资助给K.M.和D.C.D.我们感谢Evelyn Dankert和Kathrin Gruss提供的专业技术支持。好。是LING资助的DFG资助的组合神经损伤（CNI）核心设施的成员。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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