材料和试剂

100毫米培养皿（IWAKI，目录号：SH90-20）
35毫米培养皿（IWAKI，目录号：1000-035）
Eppendorf管
近交小鼠，例如携带由时钟基因启动子驱动的荧光素酶基因的雄性5-20周龄C57 / BL6小鼠（在我们的原始论文中，我们使用 Per2 :: luc 敲入小鼠和 Bmal1-Eluc 转基因小鼠，分别是来自Joseph Takahashi博士和Yoshihiro Nakajima博士的礼物）（Yoo et al。，2004 ; Noguchi et al。，2012a）
有机硅（信越，产品目录号：KS-64）
70％乙醇（Shinwa Alcohol Industry，目录号：4079210060）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Nacalai Tesque，目录号：14249-24）
DMEM（Nacalai，目录号：08456-94）
青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15070-063）
地塞米松（西格玛奥德里奇，目录号：D4902）
Luciferin（WAKO，目录号：126-05116）
二甲基亚砜
DMEM补充青霉素/链霉素（见食谱）
含荧光素的培养基（见食谱）
1,000x DEX库存（见食谱）

设备

手术剪刀（Hammacher，目录号：91-1538）
爪式镊子（FST，目录号：11154-10）
精细镊子（FST，目录号：18132-12）
层流柜（三洋，型号：MCV-B131F）
CO 2 培养箱，红外传感器不受室内湿度的影响（ASTEC，型号：SCA-165DRS）
光电倍增管（Hamamatsu，型号：LM2400）
解剖显微镜（尼康，型号：SMZ745T）

软件

用于光子探测单元C10749（LM2400v21）-JP的软件
Cosinor软件

程序

注意：

尽管培养的毛囊中昼夜周期长度的绝对值不同于从生理和行为研究中获得的那些，但我们证实了小鼠基因型的周期长度的相对差异在毛囊中的时钟基因表达和运动活性之间是相似的（ Yamaguchi et al。，2017）。因此，我们的离体方法可能是用于类比体内昼夜节律特征的有用工具。
因为据报道培养基成分会影响周期长度（Lee et al。，2011; Noguchi et al。，2012b），重要的是在所有实验组中使用相同的培养基组成和产品批号，以比较动物之间的相对差异。例如，我们发现没有酚红会导致阻尼和相对较长的时间。
地塞米松（DEX）是众所周知的外围时钟同步器。因此，经常在DEX处理后监测时钟基因表达。

分离小鼠须细胞卵泡
1. 所有动物实验方案必须得到机构动物研究委员会的批准。动物研究必须遵守机构动物护理和使用指南。图1显示了遵循实验程序所需的清洁环境和工具。
  
  图1.实验程序所需的清洁环境和工具示例
2. 在12小时光暗（LD）循环中维持携带由昼夜节律启动子/增强子元件驱动的荧光素酶基因的小鼠，并允许随意获取食物和水。
3. 安乐死后，用70％乙醇剧烈擦拭左右两侧的mystacial垫，用手术剪刀按照图2所示的推荐顺序从小鼠身上取下。为了避免损伤毛囊，插入手术剪刀并切开皮肤和骨组织之间的界面。
  
  图2.鼠标上的mystacial pad和切口线
4. 在干净的工作台上，用70％乙醇剧烈洗涤垫两次，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次，每次约15秒（视频1）。最大限度地减少每个步骤中的残留污染。
  视频1.大力清洗mystacial垫
5. 将垫移至含有25ml新鲜DMEM的100mm培养皿中，该培养皿在室温下补充有青霉素和链霉素。＆nbsp;
6. 在干净的工作台上，在解剖显微镜下仔细解剖下面所述的单个须状卵泡（推荐放大倍数：10倍）。
7. 使用爪式镊子小心地去除周围的结缔组织，而不会损坏毛囊（图3A和视频2）。尽可能彻底地去除毛囊（图3B）。
  
  图3.单个晶须卵泡的解剖。 A.移除的mystacial垫反面的图像。毛囊是看不见的，因为它们被结缔组织覆盖。使用爪式镊子小心地去除mystacial垫的结缔组织，而不会损坏毛囊。 B.黑色轮廓表示去除结缔组织后裸露的毛囊。尽可能彻底地去除毛囊。
  视频2.去除mystacial垫的结缔组织（该视频是在Yamaguchi Univ。根据山口大学动物护理指南制定的，并经山口大学动物研究伦理委员会根据方案＃298批准。）
8. 用细镊子牢牢抓住毛囊的根部并将其从皮肤上拔出，注意不要损伤毛囊（视频3）。
  视频3.从皮肤上采集毛囊（该视频是在山口大学根据山口大学动物护理的指导制作的，并由Yamaguchi大学动物研究伦理委员会根据方案＃298批准。）
离体培养小鼠须细胞卵泡以检查昼夜节律特征
1. 将分离的须状毛囊转移至另一个100-mm培养皿中，该培养皿含有25ml在室温下补充有青霉素和链霉素的新鲜DMEM。
2. （可选）参考之前的报道，根据毛球的形态和毛干的相对长度，将毛囊毛囊的毛发周期阶段分为毛发生长期或毛发生长期（Iida et al。，2007）。我们之前研究了毛发阶段差异对昼夜节律长度的影响，发现阶段间的长度没有显着差异。
3. 将50-100μl硅胶置于35mm培养皿底部偏离中心的丘中。硅胶灭菌不是必需的，但我们建议使用未开封的指定用于培养的包装中的硅胶。＆nbsp;
4. 剪掉毛干，留下约10至20毫米（图4A）。
5. 将须状卵泡转移至35-mm培养皿进行生物发光监测。每个胡须卵泡使用一个盘子。为了避免在生物发光监测过程中漂浮，将毛干推入硅胶丘中，使轴粘在硅胶上并固定在培养皿的底部（图4B）。将毛囊定位在培养皿中心附近，以进行有效的生物发光检测（图4C）。
  
  图4.将毛囊固定在培养皿的底部。 A.剪掉毛干，留下约10至20毫米。 B.将发干推入硅胶墩，使轴粘在硅胶上，并固定在烤盘底部。 C.将毛囊放在培养皿中心附近。
6. 用3ml新鲜的补充有青霉素和链霉素的DMEM覆盖固定的毛囊，并在35℃下用5％CO 2 进行预培养，以使它们从手术损伤中恢复。没有确定毛囊是否健康的具体参数。＆nbsp;
7. 在预培养1或2天后，通过添加100nM地塞米松（DEX）诱导昼夜同步，而不更换培养基并孵育2小时。为了促进DEX与培养基的混合，移取来自每个培养皿的500μl培养基，通过在Eppendorf管中移液将其与3μlDEX（100μM储液）混合，并将该混合物加入到原始培养皿中。
8. 在DEX处理期间，制备浓度为0.1mM的含荧光素的培养基。
9. 吸出含有DEX的培养基并用3ml新鲜DMEM洗涤毛囊以除去DEX，并用含有3ml荧光素的培养基覆盖毛囊。如果毛囊是健康的，则可检测到生物发光超过四天的时间。
10. 使用暗盒内的光电倍增管实时测量生物发光，专门设计用于降低背景噪声，以检测35°C时5％CO 2 的超弱光子发射（LM2400，Hamamatsu）（图5A））。为了避免生锈，LM2400在低湿度条件下位于CO 2 培养箱内：防止培养基变干，而不是使用CO 2中的水盘培养箱，使用LM2400内的一个（图5B，无菌水）。使用CO 2 培养箱，该培养箱使用不受室内湿度影响的红外传感器。测量时，打开LM2400的顶部，只需将培养皿放在金属托盘上（图5B和5C）。没有毛囊的培养皿应提供每分钟5,000-10,000个读数（阴性对照）。小肺外植体（1-2 mm 3 ）被推荐作为阳性对照，因为通过简单地用手术刀切割肺组织可以容易地制备样品，并且获得生物发光的明显昼夜节律振荡的成功率很高（> 80％）。检测清晰的昼夜节律性的成功率取决于许多因素，例如小鼠年龄，样品处理和组织类型。因此，所需的样品重复数量在实验中不同。
  
  图5.实时监测生物发光。生物发光可以使用光电倍增管（LM2400）在35°C和5％CO 2 下实时测量。 A.光电倍增管（PMT）的位置。插图中的箭头以两个PMT的放大视图指示光子输入窗口。 B. LM2400内部金属托盘上的培养皿。 C. B.的局部放大图像

数据分析

使用相关软件“用于光子检测单元的软件C10749（LM2400v21）-JP”执行数据收集。要分析昼夜节律参数，需要删除基线变化。因此，如图6所示，使用Microsoft Excel从原始数据中减去24小时运行平均值（图6A，原始数据;图6B，去趋势数据），原始数据集被去趋势化。使用由Refinetti博士提供的去趋势数据和Cosinor软件计算昼夜节律稳健性，昼夜节律阶段（角度）和昼夜周期长度。

图6.示例数据。通过从原始数据中减去24小时运行平均值来去除数据集。 A.原始数据（纵轴：每分钟原始计数）; B.去趋势数据（纵轴：每分钟去趋势的相对计数）。

食谱

DMEM补充青霉素和链霉素
DMEM
1％青霉素/链霉素
含荧光素的培养基（无需过滤）
DMEM
1％青霉素/链霉素
0.1 mM荧光素（使用溶于盐水的10 mM原液）
1,000x DEX库存（无需过滤）
二甲基亚砜
100μM地塞米松

致谢

我们感谢Ritsuko Matsumura，Rie Okamitsu和Junko Sumino的专业技术支持。我们非常感谢Takashi Matsuzaki（岛根大学）和Roberto Refinetti（博伊西州立大学）获得技术支持和Cosinor软件。该协议最初是在Yamaguchi et al。（2017）中开发的。我们感谢山口老年学研究所，Akaeda医学研究基金会，SENSHIN医学研究基金会和日本科学促进会的奖学金。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

伦理

所有动物实验方案均经山口大学动物研究委员会批准。根据山口大学动物护理和使用指南进行动物研究。

参考

Iida，M.，Ihara，S。和Matsuzaki，T。（2007）。毛发周期依赖性碱性磷酸酶活性在小鼠触须毛囊间充质和上皮变化。 Dev Growth Differ 49（3）：185-195。
Kume，K.，Zylka，M.J.，Sriram，S.，Shearman，L.P.，Weaver，D.R.，Jin，X.，Maywood，E.S.，Hastings，M.H。和Reppert，S.M。（1999）。 mCRY1和mCRY2是生物钟反馈循环的负面部分的重要组成部分。 Cell 98（2）：193-205。
Lee，S.K.，Achieng，E.，Maddox，C.，Chen，S.C.，Iuvone，P.M。和Fukuhara，C。（2011）。细胞外低pH值会影响人原代成纤维细胞的昼夜节律表达。 Biochem Biophys Res Commun 416（3-4）：337-342。
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Schibler，U.，Gotic，I.，Saini，C.，Gos，P.，Curie，T.，Emmenegger，Y.，Sinturel，F.，Gosselin，P.，Gerber，A.，Fleury-Olela，F 。，Rando，G.，Demarque，M。和Franken，P。（2015）。时钟说话：哺乳动物中枢和外周昼夜节律振荡器之间的相互作用。 Cold Spring Harb Symp Quant Biol 80：223-232。
Stokkan，K.A.，Yamazaki，S.，Tei，H.，Sakaki，Y。和Menaker，M。（2001）。通过喂食来夹带肝脏中的生物钟。 Science 291（5503）：490-493。
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Yamaguchi，A.，Matsumura，R.，Matsuzaki，T.，Nakamura，W.，Node，K。和Akashi，M。（2017）。使用离体培养毛囊组织来研究内在的一种简单方法人类的昼夜节律特征。 Sci Rep 7（1）：6824。
Yamazaki，S.，Numano，R.，Abe，M.，Hida，A.，Takahashi，R.，Ueda，M.，Block，GD，Sakaki，Y.，Menaker，M。和Tei，H。（2000 ）。重置转基因大鼠的中枢和外周昼夜节律振荡器。 Science 288（5466）：682-685。
Yoo，SH，Yamazaki，S.，Lowrey，PL，Shimomura，K.，Ko，CH，Buhr，ED，Siepka，SM，Hong，HK，Oh，WJ，Yoo，OJ，Menaker，M。和Takahashi，JS （2004年）。 PERIOD2 :: LUCIFERASE昼夜节律动态实时报告显示小鼠外周组织中持续的昼夜节律振荡。 / a> Proc Natl Acad Sci USA 101（15）：5339-5346。