材料和试剂

移液器吸头
1. P2提示（Gilson，目录号：F171200）
2. P200提示（Gilson，目录号：F171300）
3. P1000提示（Gilson，目录号：F171500）
牙签和接种棒（灭菌）（VWR，目录号：12000-806）
培养皿（康宁，目录号：351029）
Assay Plate，96孔，U底（Falcon，目录号：62406-015）
1.5毫升微量离心管（Fisherbrand，目录号：05-408-129）
1. yEG001
2. yEG322
3. yEG315
4. yEG372
5. yEG375
50毫升锥形离心管（Falcon，目录号：14-432-22）
酵母菌株（表1）
矢量pMN3（空矢量）（McIsaac et al。，2013）
向量pMN3- SET4 （Tran et al。，2018）
无菌蒸馏水
酵母提取物（国际研究产品，目录号：Y20025）
蛋白胨（国际研究产品，目录号：P20250）
葡萄糖（Thermo Scientific，目录号：BP350-1）
酵母氮碱（US Biologicals，目录号：Y2025）
Drop-out Mix Synthetic Minus Uracil（US Biologicals，目录号：D9535）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
过氧化氢（Fisher Scientific，目录号：H325-100）
β-雌二醇（Millipore Sigma，目录号：E2758-1G）
琼脂（美国生物，目录号：A0930）
YPD（酵母提取物 - 蛋白胨 - 葡萄糖）培养基（见食谱）
合成完全没有尿嘧啶（SC-URA）培养基（见食谱）
10mMβ-雌二醇（见食谱）

表1.本协议中使用的酵母菌株

设备

125毫升（或50毫升，如果有的话）锥形瓶（VWR，目录号：10536-912）
玻璃电池扩展器（VWR，目录号：89166-788）
单通道移液器
1. P2移液器（Gilson，目录号：F144054M）
2. P20移液器（Gilson，目录号：F144056M）
3. P200移液器（Gilson，目录号：F144058M）
4. P1000移液器（Gilson，产品目录号：F144059M）
玻璃培养管（15 ml）（Corning，目录号：982016X）
多通道移液器（Pipetman Neo P8 x 20N和Pipetman Neo P8 x 200N）＆nbsp;
恒温箱
Rollordrum Tc-7组织培养旋转器（New Brunswick Scientific）
孵化器振荡器（New Brunswick Scientific G-25，所需温度：30°C;振动筛尺寸：22英寸x 45.5英寸x 30.5英寸）
Vortexer（VWR标准重型涡旋混合器，目录号：97043-562）
分光光度计（Thermo Scientific，型号：NanoDrop 2000c，目录号：ND-2000c）
MultiDoc-it成像系统（UVP）
离心机（Beckman Coulter Allegra X-14R，目录号：A99465）
Microfuge（Beckman Coulter Microfuge 20R）
高压灭菌器（Steris AMSCO Century SG-120科学重力灭菌器）

软件

Excel，Microsoft Office
Prism GraphPad

程序

通过斑点试验评估野生型和突变型酵母细胞的存活率
1. 将野生型和突变体酵母菌株（表1）条带化为YPD平板上的单菌落。在30°C孵育2天。
2. 使用无菌牙签，选择单个野生型和突变体菌落。将菌落重悬于离心管中的100μlYPD中。使用UV-VIS分光光度计（例如，NanoDrop 2000c）测量OD 600 并计算以确定达到OD 600 <的最终细胞浓度所需的体积/ sub>在30ml YPD中等于0.0006。将该体积的培养物稀释到30ml YPD中并生长过夜（对于来自储存在4℃的平板的菌落约16-18小时，或来自来自30℃培养箱的平板的菌落约12-14小时）在30℃下以220rpm振荡进行对数中期（OD 600 ~0.4-0.5）。＆nbsp;
3. 测量培养物的OD 600 。确定相当于~12 OD 600 单位的培养物体积。例如，OD 600 0.5的培养物的12个OD 600 单位等于24ml培养物（12分0.5）。将计算的体积转移至50ml锥形离心管中，并以3,900 x g 离心3分钟。＆nbsp;
4. 去除上清液，并将细胞重悬于20ml预热的YPD中。
5. 通过涡旋充分混合培养物，并向每个待测菌株的两个无菌烧瓶中加入10ml培养物。
6. 向其中一个烧瓶中，在10ml培养物中加入H 2 O 2 至4mM终浓度。市售的H 2 O 2 通常为30％（w / w），密度为1.1g / ml，分子量为34.01g / mol。因此，储备浓度为9.79M，并且4.08μl的储备液在10ml培养物体积中产生4mM的终浓度。确定原液摩尔浓度的计算如下：
  1. 储备溶液：30g H 2 O 2 / 100g H 2 O＆nbsp;
  2. 100g H 2 O / 1.1g / ml = 90.9ml用于30g H 2 O 2 的溶液
  3. （30g H 2 O 2 /90.9ml)x 100 = 33.3g H 2 O 2 in 100 ml H 2 O.
  4. 33.3g H 2 O 2 /34.01 g / mol = 0.979 mol，100 ml = 9.79 M
7. 将所有烧瓶置于振荡器中并继续在30℃下孵育30分钟。
8. 孵育30分钟后，从每种培养物中取出1ml并置于1.5ml微量离心管中。在12,200 x g 离心2分钟。＆nbsp;
9. 吸出上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml无菌蒸馏水中。
10. 在96孔板中设置10倍稀释的细胞系列。每种菌株都有一排单独的细胞。在第一个孔中，加入200μl未稀释的细胞。在接下来的五口井中，加入180μl无菌水。对于每种菌株，取20μl未稀释的细胞，并使用多通道移液管将其加入下一个孔（含有180μl水）中。向上和向下移液以混合样品。然后取20μl该稀释液并将其加入下一个孔中。向上和向下移液以混合并将20μl转移至下一个孔。重复以完成稀释系列。＆nbsp;
11. 使用多通道移液器，将每孔5μl点到YPD板上。从最稀释的样品开始，以未稀释的样品结束。＆nbsp;
12. 让斑点在平板上干燥，然后转移到30℃的培养箱中。
13. 来自未处理的培养物的细胞应在第2天可见，而来自用H 2 O 2 处理的培养物的细胞可能需要长达5天才能看到。使用凝胶文档或其他成像系统，每天在黑色背景上用白光拍摄板材照片。代表性的图像如图1所示。图2中提供了概述该协议步骤的流程图。
  
  图1.斑点测定的代表性图像YPD平板显示 wt 和set4Δ细胞的连续稀释液，未经处理或用4 mM H 2 <处理/ sub> O 2 在定位板上之前。在30°C温育两天后获得图像。此类数据对应于程序A中描述的实验大纲。
  
  图2.描述程序A的实验大纲的流程图。流程图中显示的许多步骤与程序C中使用的步骤类似，其中 SET4 （或感兴趣的基因）过度表达。＆nbsp;
通过计数菌落形成单位（cfu）评估野生型和突变型酵母细胞的存活率
1. 按照步骤A1-A2生长酵母菌株，除了每种培养物仅生长10毫升而不是30毫升。＆nbsp;
2. 当培养物达到对数中期（OD 600 ~0.4-0.5）时，去除10μl的每种培养物以进行连续稀释，并按照步骤B3用H 处理剩余的培养物。 2 0 <子> 2 。在培养物孵育时（如下所述），将10μl稀释到990μl无菌蒸馏水中，然后进行第二次1：100连续稀释。使用玻璃板涂布器将100μl稀释的细胞铺板到YPD板上，表示1：1×10 5 稀释液（或稀释因子DF，10 5 ）原始文化。＆nbsp;
3. 在进行稀释和平板接种时，用H 2 O 2 处理培养物至4 mM终浓度（4.08μlH 2 O < 10ml培养物中的sub> 2 原液）。继续在30°C振荡30分钟。
4. 孵育后，取出10μl每种培养物，并稀释一次，加入990μl无菌蒸馏水中。使用玻璃板涂布器将100μl稀释的细胞铺板到YPD板上，表示1：1×10 3 稀释液（或稀释因子DF，10 3 ）原始文化。＆nbsp;
5. 将板在30℃孵育2天。计算每个平板上的菌落并记录值以计算存活百分比，如表2所示并在数据分析部分中描述。概述此协议中步骤的流程图如图3所示。＆nbsp;
  
  表2.评估过量表达酵母存活率的原始数据和百分比存活计算 SET4
  
  图3.描述程序B的实验大纲的流程图。流程图中显示的许多步骤与程序D中使用的步骤类似，其中 SET4 （或感兴趣的基因）过度表达。＆nbsp;
通过斑点试验评估酵母过表达菌株的存活率
1. 为了测试过表达目的基因的细胞的存活，使用酵母菌株yEG315并用载体pMN3转化（Gietz和Schiestl，2007），其在β-雌二醇存在下驱动克隆基因的过表达（菌株和质粒由Scott McIsaac;表1 [McIsaac et al。，2013]）。
2. 将含有空载体或过表达载体的酵母条纹连接到SC-URA平板上至单菌落。在30°C孵育2天。
3. 使用无菌接种棒挑取单个菌落，并在15ml玻璃培养管中接种3ml SC-URA培养基，并在30℃下振荡生长过夜。＆nbsp;
4. 第二天，使用分光光度计测量OD 600 。在20ml SC-URA培养基中将培养物稀释至OD 600 ~0.1-0.2。
5. 在乙醇中新鲜制备10mMβ-雌二醇。在乙醇中进一步稀释至0.1mM并向每种培养物中加入1μMβ-雌二醇。
6. 在30℃下振荡孵育培养物。生长至对数中期（OD 600 ~0.5-0.7;约4-6h）。
7. 测量培养物的OD 600 并计算相当于~12 OD 600 单位的培养物体积，如程序A中所述。
8. 将计算的体积转移至50ml锥形离心管中，并以3,900 x g 离心3分钟。
9. 重悬于20ml预热的SC-URA培养基中。
10. 旋转以很好地混合培养物，并将10ml培养物移至新的烧瓶中，以便每个待测菌株都有两个烧瓶。＆nbsp;
11. 向其中一个烧瓶中加入H 2 O 2 至终浓度20 mM（20.43μl的H 2 O 2 < / sub> 10ml培养物中的储备量）。
12. 将所有烧瓶置于振荡器中并继续在30℃下孵育30分钟。
13. 孵育30分钟后，从每种培养物中取出1ml并置于1.5ml微量离心管中。在12,200 x g 离心2分钟。＆nbsp;
14. 吸出上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml无菌蒸馏水中。＆nbsp;
15. 按照步骤A10-A13设置10倍系列稀释液，SC-URA平板上的斑点细胞，并在30℃生长2-3天后拍摄平板图像。＆nbsp;
通过计数菌落形成单位（cfu）来评估酵母过表达菌株的存活率
1. 遵循步骤C1-C4，除了在SC-URA（而不是20ml）中仅培养10ml培养物。＆nbsp;
2. 在乙醇中新鲜制备10mMβ-雌二醇。在乙醇中进一步稀释至0.1mM并向每种培养物中加入50nMβ-雌二醇。
3. 当培养物达到对数中期时（在30℃下4-6小时; OD 600 ~0.5-0.7），除去10μl每种培养物并进行连续稀释。将10μl稀释到990μl无菌蒸馏水中，并进行第二次1：100连续稀释。使用玻璃板涂布器将100μl第二稀释液涂布在SC-URA板上，表示原始培养物的1：1×10 5 稀释度。＆nbsp;
4. 在进行稀释和电镀细胞时，最终浓度为20 mM H 2 O 2 （20.43μlH 2 O）处理培养物在10ml培养物体积中 2 储备液30分钟。继续在30°C下摇动。
5. 孵育后，取出10μl每种培养物，并稀释一次，加入990μl无菌蒸馏水中。使用玻璃板涂布器将100μl稀释的细胞铺板到SC-URA板上，表示原始培养物的1：1×10 3 稀释度。＆nbsp;
6. 将板在30℃孵育2天。计算每个平板上的菌落并记录值以计算存活百分比，如表2所示。

数据分析

对于斑点测定试验，使用凝胶记录系统对板进行成像，以定性评估过氧化氢处理后的存活率。这些数据的实例显示在Tran 等人的图2A和2E中（2018）。为了使用菌落形成单位（cfu）测定法定量测量存活率，将每个平板上的菌落总数乘以稀释因子（DF）。通过将H 2 O 2 处理的细胞的总菌落计数除以未处理细胞的总菌落计数并乘以100来确定每个重复的存活百分比，如表2所示。确定重复的平均值，并使用未配对的 t - 测试评估统计学显着性。用GraphPad Prism分析这些数据。表2中所示的原始数据和计算在图2F中以图形方式表示在Tran 等人（2018）中。

笔记

对于此处描述的两组方案，推荐的培养体积增长至对数期并进行H 2 O 2 处理，在锥形瓶中至少为10 ml 。尽管这比通过斑点测定或cfu测定所需的体积大得多，但我们发现这种培养物体积增加以提供更可重复的结果。当用在培养管和较小体积培养基中生长的细胞进行类似测定时，结果变化更大，可能是由于培养物的通气减少。
＆NBSP; H 2 O 2 处理步骤的另一个考虑因素是这里使用的不同介质类型，富含YPD介质或合成介质。在合成培养基中生长的细胞（完全或辍学）产生固有的抗逆性，因此在H 2 O 2 处理时表现出更高的存活率。因此，当细胞在合成培养基（例如方法C和D）中生长而不是富含培养基时，需要更高浓度的H 2 O 2 。我们发现YPD中的4mM H 2 O 2 和合成培养基中的20 mM H 2 O 2 野生型细胞的存活率相当。然而，取决于精确的培养基组成和生长条件，在中试实验中测试一系列H 2 O 2 浓度可用于测定优化。

食谱

YPD（酵母提取物 - 蛋白胨 - 葡萄糖）培养基（1升）
10克酵母提取物
20克蛋白胨
20克右旋糖（葡萄糖）
加入1升蒸馏水，充分混合，高压灭菌消毒要制作YPD平板，在高压灭菌前加入25 g琼脂。在高压灭菌的材料冷却到足以处理之后，倒入培养皿中
合成完全没有尿嘧啶（SC-URA）培养基（1升）
1.92克尿嘧啶辍学混合物
6.7克酵母氮碱
20克右旋糖（葡萄糖）
加入1升蒸馏水，充分混合，高压灭菌消毒要制作SC-URA板，在高压灭菌前加入25 g琼脂。在高压灭菌的材料冷却到足以处理之后，倒入培养皿中
10mMβ-雌二醇
1.1毫克β-雌二醇
400μl乙醇
使用前要新鲜。如有必要，如协议中所述进一步稀释以进行精确移液

致谢

该协议是基于作者先前公布的结果开发的（Tran et al。，2018）。这项工作部分得到NIH资助R01GM124342到E.M.G的支持。内容完全由作者负责，并不一定代表国立卫生研究院的官方观点。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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Guan，Q.，Haroon，S.，Bravo，D.G.Will，J.L。和Gasch，A.P。（2012）。酿酒酵母中获得性抗逆性的细胞记忆。 Genetics 192（2）：495-505。
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Morano，K.A.，Grant，C.M。和Moye-Rowley，W。S.（2012）。对酿酒酵母中热休克和氧化应激的反应。 Genetics 190（4）：1157-1195
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Weiner，A.，Chen，HV，Liu，CL，Rahat，A.，Klien，A.，Soares，L.，Gudipati，M.，Pfeffner，J.，Regev，A.，Buratowski，S.，Pleiss， JA，Friedman，N。和Rando，OJ（2012）。系统剖析染色质调节因子在酵母应激反应中的作用。 PLoS Biol 10（7）：e1001369。