材料和试剂

移液器吸头
1毫升结核菌素注射器（TERUMO，目录号：SS-01T）＆nbsp;
21 G针（TERUMO，目录号：NN-2138R）
23 G针（TERUMO，目录号：NN-2325R）
15毫升或50毫升管
免疫缺陷小鼠（8-10周龄BALB / c nu / nu或NOD-SCID小鼠）
肿瘤细胞（例如，4T1，Cl66和Cl66M2鼠乳腺癌细胞[Wilson et al。，2008]，大鼠前列腺癌细胞[Lynch et al。，2005]，MDA-MB-231-Luc人乳腺癌细胞[Cell Biolabs，目录号：AKR-231]，等。）
注意：稳定表达肿瘤细胞的荧光素酶（例如，MDA-MB-231-Luc细胞）用于体内IVIS / em> 成像系统。
麻醉剂
用0.3mg / kg美托咪定（ZENOAQ），4.0mg / kg咪达唑仑（Sandoz K.K.）和5.0mg / kg布托啡诺（Meiji Seika Pharma Co.，Ltd。）制备组合麻醉剂。
PBS
Matrigel Matrix Basement（康宁，目录号：354234，储存温度-20°C）
D-luciferin（Summit Pharmaceuticals International，目录号：XFL-1，储存温度-20°C）
2.5 g / L胰蛋白酶/ 1 mmol / L EDTA溶液（NACALAI TESQUE，目录号：32777-15）

设备

移液器
离心机（TOMY，EX-125）
IVIS 体内成像系统（PerkinElmer，IVIS Lumina III）
微型计算机断层扫描（扫描：Rigaku，R_mCT2;分析：Ratoc，TRI / FCS-BON）

程序

肿瘤细胞制备
1. 根据指定的培养方法培养肿瘤细胞。
  注意：4T1，Cl66和Cl66M2鼠乳腺癌细胞，MDA-MB-231-Luc人乳腺癌细胞和大鼠前列腺癌细胞用于作者之前的研究。
2. 吸出培养基并加入PBS冲洗细胞。
3. 吸出PBS并加入0.25％胰蛋白酶/ EDTA溶液。
  注意：通过倾斜培养板确保溶液覆盖细胞的整个表面。
4. 将细胞在37℃下在潮湿的5％CO 2 环境中孵育几分钟。
5. 添加培养基以中和胰蛋白酶，通过来回移液培养基分离贴壁细胞，并制备单细胞悬浮液。
6. 将细胞悬浮液转移到15ml或50ml管中，并在4℃下以500×g离心5分钟离心。
7. 吸出上清液，将细胞沉淀重悬于冷PBS中，并计数细胞数。
8. 再次离心细胞悬液，用冷基质胶重悬细胞沉淀，每100μl基质胶3×10 6个细胞。
  注意：基质胶在4°C时是液体。当保持在24-37℃时，它聚合成固体凝胶。
9. 将重悬的细胞保持在冰上，直到细胞被植入。
肿瘤细胞植入小鼠颅骨（图2）

小鼠颅骨的解剖
小鼠颅骨主要由额骨，顶骨和顶骨组成（图1A和1B）。有两种主要的中线缝合线：成对的额骨之间的间距缝合和成对的顶骨之间的矢状缝合。此外，还有两种主要的横向缝线：额骨和顶骨之间的冠状缝线以及顶骨和顶骨之间的lambdoid缝合线（图1A）。

图1.小鼠颅骨的三维μCT重建。 A.顶视图。 B.横向观点。
1. 准备8-10周龄的BALB / c-nu / nu或NOD-SCID小鼠进行实验。
2. 如先前报道的那样通过腹膜内注射麻醉剂麻醉小鼠（Kawai et al。，2011）。＆nbsp;
3. 将21 G针插入前额皮肤（图2A，X：针插入点）并用针尖刮擦颅骨骨膜以暴露骨表面（图2B）。
  注意：完全暴露骨表面对于肿瘤植入非常重要。
4. 将细胞悬液转移到1 ml注射器中并连接23 G针头。
  注意：在转移之前，通过上下移液确保细胞均匀悬浮。＆nbsp;
5. 从同一皮肤孔插入注射针，并在颅骨上注射100μl（3×10 6 细胞）的细胞悬液（图2C）。
6. 拔出针头后，用手指捏住注射孔约30秒，直到Matrigel聚合成固体凝胶（图2D和2E）。
  注意：注意不要让细胞悬浮液从孔中渗漏。
7. 将注射的鼠标放在加热垫上并监视它直到它完全变得清醒。
  
  图2.小鼠颅骨上的癌细胞植入
植入后
1. 定期监测肿瘤生长情况。＆nbsp;
2. 用游标卡尺每周测量植入部位的肿瘤大小。
3. 每周或每2周进行IVIS 体内成像和微型计算机断层扫描（μCT）扫描，并检查肿瘤，溶骨性病变或成骨细胞病变的大小（参见数据分析）。
4. 在植入后约3-6周（基于μCT分析）牺牲植入的小鼠并收获所得肿瘤用于进一步分析（例如，组织学分析和基因表达分析）。
  注意：在早期时间点，观察到颅骨的变化很小或没有变化。在植入肿瘤细胞后约2-4周（取决于植入的肿瘤细胞）肉眼观察到溶骨性或成骨细胞损伤。

数据分析

影像肿瘤生长和骨病变：

IVIS成像系统：荧光素是一种常见的生物发光报道分子，用于体内荧光素酶表达的成像。在植入稳定表达肿瘤细胞的荧光素酶（例如，MDA-MB-231-Luc细胞，等）后，建议每周进行IVIS成像系统。在成像之前，在麻醉条件下将300μl（4.5mg）D-荧光素（15mg / ml）腹膜内注射到植入的小鼠中。使用IVIS Lumina III在注射后10分钟获得图像。在不同时间点研究相同的小鼠。如果成功植入肿瘤细胞，则在植入后生物发光强度逐渐增加（图3A和3B）。有时，植入的肿瘤细胞（例如，LNCaP和C4-2人类前列腺癌细胞等）无法存活。失败的确切原因仍不清楚。通常，植入的细胞越多，细胞就越容易存活。

图3.植入的MDA-MB-231-Luc细胞的IVIS 体内成像。 A.IVIS图像。 B.从植入的肿瘤细胞发射的光子的生物发光强度（总通量[p / s]）。数据是平均值±SEM（n = 5）。
微型计算机断层扫描（μCT）分析：建议在植入肿瘤细胞后每周或每2周进行一次μCT分析。使用等长分辨率为40μm的R_mCT2（Rigaku）在麻醉条件下进行μCT扫描，并使用TRI / FCS-BON（Ratoc）重建图像。在植入溶骨性表型诱导肿瘤细胞（例如，，MDA-MB-231细胞）的情况下，可以在植入后4-6周观察到溶骨性病变。骨吸收区域逐渐变大（图4A）。另一方面，在成骨细胞表型诱导肿瘤细胞（例如，大鼠前列腺癌细胞[Lynch et al。，2005]，hsa-miR-的情况下）植入表达940的MDA-MB-231乳腺癌细胞[Hashimoto et al。，2018]，等），成骨后病变可在出现后10-14天出现植入（图4B）。

图4.植入部位的三维μCT重建。 A.骨溶解性病变。 B.成骨细胞病变。

致谢

这项工作得到了科学研究助学金（KAKENHI，＃24791567和＃26893068）的支持。这项工作也得到了进化科学与技术核心研究（CREST，＃JP17gm0610008）的支持。

利益争夺

所有作者均声明不存在利益冲突。

伦理

所有关于颅骨植入的动物实验均经内布拉斯加大学医学中心，名古屋市立大学，长崎大学和东京医科大学动物研究委员会批准，并符合相关指南和法规。

参考

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Kawai，S.，Takagi，Y.，Kaneko，S。和Kurosawa，T。（2011）。三种混合麻醉剂替代小鼠氯胺酮的效果。 Exp Anim 60（5）：481-487。
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Wilson，T。J.，Nannuru，K.C.，Futakuchi，M.，Sadanandam，A。和Singh，R。K.（2008）。 Cathepsin G通过产生核因子-κB配体的可溶性受体激活剂来增强乳腺肿瘤诱导的骨质溶解。 / a> Cancer Res 68（14）：5803-5811。