材料和试剂

材料
1. 移液器吸头（Thermo Scientific）
2. Eppendorf试管，1.5 ml（Eppendorf，目录号：05-402-5）
3. 1 ml无菌sub-Q注射器26 G（BD，目录号：3095971）
4. 无菌细胞过滤器70μm尼龙网（Fisher Scientific，目录号：22363548）
5. 50毫升离心管（Fisher Scientific，目录号：05-539-13）
6. 15毫升锥形离心管（Fisher Scientific，目录号：339650）
7. 15毫升无菌塑料管（Fisher Scientific，目录号：14-956-1D）
8. 5 ml Serological pipettes（Falcon，目录号：357543）
9. 25 ml血清移液器（Fisher Brand，目录号：13-678-11）
10. 培养皿（Falcon，目录号：351029）
11. 血清或血浆分离管（SARSTEDT，目录号：41.1378.005）
12. Parafilm（Pechiney，目录号：PM-996）
13. V底96孔板（Costar，目录号：3894）
14. 70μm细胞过滤器
动物
8至12周龄 Rag 2 - / - 小鼠（Taconic，目录号：RAGN12）用于研究抗CD40介导的结肠炎。
试剂
1. 液氮
2. 抗小鼠CD45 APC-eFluor780抗体（eBioscience，目录编号：47-0451-82）
3. 抗小鼠CD90.2 BV786抗体（BD Bioscience，目录编号：564365）
4. 抗小鼠RORγtPerCP-eFluor710抗体（eBioscience，目录编号：46-6981-82）
5. 抗小鼠NK1.1 Alexa Fluor 700抗体（BD Bioscience，目录号：560515）
6. 抗小鼠CD11c PE-Cy7抗体（BD Bioscience，目录编号：561022）
7. 抗小鼠CD11b FITC抗体（BD Bioscience，目录编号：557396）
8. 抗小鼠IL-22 APC抗体（eBioscience，目录编号：17-7222-82）
9. Endotoxin-free抗CD40抗体（克隆FKG45，BioXCell，目录号：BE0016-2）
10. 抗大鼠IgG2a同种型对照（克隆2A3，BioXCell，目录号：BP0089）
11. HyClone磷酸盐缓冲盐水（DPBS），1x（GE Healthcare，目录号：SH30028.02）
12. 汉克的缓冲盐溶液（HBSS）
13. 10％中性缓冲福尔马林（赛默飞世尔科技，目录号：245-685）
14. 青霉素/链霉素溶液100x（Corning，目录号：30-002C1）
15. 丙酮酸钠100 mM（Gibco，目录号：11360070）
16. 2-Mercaptoethanol 55 mM（Gibco，目录号：21985023）
17. 超纯0.5μMEDTApH 8.0（Gibco，目录号：15575-038）
18. HEPES缓冲溶液1 M（Gibco，目录号：15630-080）
19. Hyclone标准胎牛血清（FBS）（赛默飞世尔科技，目录号：SH30088.03）
20. VIII型胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C2139）
21. DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：D5025）
22. Dispase（Corning，目录号：354235）
23. Percoll（GE Healthcare，目录号：17-0891-01）
24. IMDM，GlutaMAX补充剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：31980097）
25. Phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P8139）
26. 离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：I0634）
27. Brefeldin A（BD Bioscience，目录号：555029）
28. 染色缓冲液（BD，Pharmingen，目录号：554656）
29. 转录因子缓冲液组（BD，Pharmingen，目录号：562725）
30. 固定活力污渍510（BD，Horizon，目录号：564406）
31. 小鼠BD Fc Block（BD，Pharmingen，目录号553141）
32. 乙醇70％（Fisher Scientific，目录号：HC1500）
33. 乙醇95％（Fisher Scientific，目录号：HC1300）
34. 乙醇100％（Fisher Scientific，目录号：HC600）
35. 二甲苯（Fisher Scientific，目录号：HC700）
36. 石蜡（Fisher Scientific，目录号：23-0210-400）
37. 苏木精（MasterTech Scientific，目录号：HXHHEGAL）
38. Eosin（Thermo Scientific，目录号：71311）
39. 胶原酶D（Sigma，目录号：C5138-1G）
40. 上皮细胞解离解决方案（见食谱）
41. 酶消化混合物（见食谱）
42. 完整的IMDM媒体（参见食谱）

设备

Scalpel（Southmedic，目录号：SMI1 / 73-0121）
移液器（Thermo Scientific）
镊子和剪刀（精细科学工具）
无菌细胞培养罩
离心机（赛默飞世尔科技）
摇水浴（精密）
明场显微镜
LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）
恒温箱
Vortex（科学工业）

软件

FlowJo_V10（FlowJo，LLC， https://www.flowjo.com ）
GraphPad Prism 7（GraphPad， https://www.graphpad.com ）
Microsoft Excel（Microsoft）

程序

Rag 2 - / - 小鼠结肠炎的诱导
1. 在无菌1x PBS中将抗CD40抗体或同种型对照稀释至1mg / ml。
2. 根据研究人员的技术专长，用1 ml无菌sub-Q注射器26 G注射100μg抗CD40或同种型对照抗体腹膜内（ip）或50μg静脉注射（iv） - 每批抗CD40抗体应该被证实不含内毒素（通过与制造商核实）以避免全身免疫激活。
  注意：
  1. 每个动物设施都有特定的微生物环境，因此通过初始剂量滴定（25-100μg）凭经验确定抗CD40的剂量至关重要（图2）。
  2. 过高的剂量会导致动物死亡，而剂量不足会导致疾病诱导不良（结肠炎症不一致或不良）和结肠炎发展的变异。＆nbsp;
  3. 每天对小鼠进行连续七天的称重，并计算与第0天的初始体重相比的体重减轻％。在24小时内对失去超过初始体重的20％或表现出摇晃或严重全身反应的小鼠实施安乐死。小时。
  4. 结肠炎的体重减轻动力学可能在i.p.之间变化。和i.v.注射类型。在我们手中，小鼠在i.p.后更快地恢复体重。交货。然而，注射途径不会改变结肠炎发展的时间或严重程度。
3. 在诱导后第2-7天，根据批准的伦理方案通过二氧化碳窒息使小鼠安乐死。
4. 通过心脏穿刺收集血清，用于检测全身细胞因子水平。
  
  图2.抗-CD40抗体的滴定。 Rag 2 - / - 小鼠静脉内接受单剂量的抗-CD40抗体。如..所示。 7天内初始重量的百分比。在注射抗CD40抗体之前立即测量初始重量。
用于终点分析的结肠组织/细胞的分离和制备
1. H＆amp; E染色的组织病理学分析
  1. 通过用镊子轻轻地从结肠中移出来收集结肠并去除粪便内容物。将结肠卷入组织包埋盒中，其近端位于中心，并在10％中性缓冲福尔马林中固定过夜（盒子需要浸没）。
  2. 将盒子转移到70％乙醇中，以4-5μm的浓度包埋在石蜡中，然后用苏木精染色10分钟，并如前所述用曙红染色（Wang et al。，2017）。
  3. 用自来水冲洗直至水清澈。
  4. 将载玻片转移至Eosin溶液并孵育3分钟。
  5. 依次将载玻片转移到70％乙醇中20秒，90％乙醇20秒，100％乙醇1分钟，二甲苯3分钟。
  6. 从二甲苯中取出载玻片，在通风橱中将其擦干。
  7. 安装并覆盖幻灯片。
2. 近端结肠的基因表达谱分析
  1. 在诱导结肠炎后的所需时间点，根据批准的伦理方案，通过二氧化碳窒息使小鼠安乐死。
    注意：为了分析编码由先天免疫细胞产生的细胞因子的基因，我们建议在诱导后第1天至第3天对小鼠实施安乐死。为了分析由炎症引起的上皮细胞表达的基因，我们建议在诱导后第7天对疾病最大化时对小鼠进行安乐死。
  2. 收获一块近端结肠（约0.5厘米长），用镊子轻轻地从结肠中取出粪便，转移到无菌聚丙烯管中，在液氮中快速冷冻（图3B）。由于炎症浸润可以变化，因此从盲肠基部开始切割结肠的垂直部分并下降到近端结肠以确保一致的分子特征是很重要的。
    注意：为避免RNA降解，样品必须在安乐死后2分钟内在液氮中快速冷冻。冷冻近端结肠可以在-80°C下保存至少6个月。
  3. 如Bauche et al。，2018中所述提取RNA并运行RT-PCR方案。
3. 近端结肠固有层细胞的分离，离体刺激和流式细胞术
  近端结肠固有层细胞的分离
  1. 诱导后2-7天，根据批准的伦理方案，通过二氧化碳窒息杀死小鼠。
  2. 在装有5毫升1x HBSS的15毫升Falcon试管中收集并收集近端结肠。＆nbsp;
  3. 去除脂肪（图3A）。
  4. 将结肠转移到培养皿中。
  5. 将结肠纵向切开并浸没并在50ml 1x HBSS中轻轻摇动直至组织中没有粪便物质进行洗涤。＆nbsp;
  6. 切成0.5厘米的部分。＆nbsp;
  7. 置于含有20ml上皮细胞解离溶液的50ml Falcon管中。＆nbsp;
  8. 用封口膜包裹，在37℃的水浴中侧向放置20分钟，中等摇动。
  9. 涡旋15秒。
  10. 通过70微米过滤器过滤，收集并转移未消化的结肠组织，放入新的50毫升falcon管中。＆nbsp;
  11. 用20ml 1x HBSS冲洗片段，轻轻涡旋10秒。
  12. 将结肠碎片转移到培养皿中，用手术刀切成小块。
  13. 使用25ml血清移液管，转移到具有10ml酶消化混合物的新的50ml管中，然后在37℃的水浴中如上所述摇动孵育20分钟。
  14. 涡旋15秒。
  15. 通过70μm细胞过滤器过滤收集sup并置于冰上。在375 x g ，4℃下沉淀细胞5分钟。
  16. 制备100％Percoll溶液（9份Percoll + 1份10x PBS）。
  17. 通过用1x PBS稀释100％Percoll制备40％和80％Percoll溶液。
  18. 在15ml管中，使用5ml血清移液管将沉淀重悬于5ml 40％Percoll中，并在每个结肠中用5ml 80％Percoll垫层。
  19. 在20℃下旋转670 x g 20分钟，没有加速且没有制动。
  20. 将两层percoll之间的界面（白色环）收集到15ml管中，用10ml完全IMDM培养基洗涤并在375℃下旋转5分钟，4℃。＆nbsp;
  21. 重悬于1毫升完全IMDM中，细胞准备就绪。
  注意：界面的特征是白色环，主要包含结肠固有层免疫细胞。应在此步骤测量细胞数和活力。
  
  离体刺激
  1. 对于细胞因子分析，在96孔板中在37℃，5％CO 2 50 ng / ml刺激2 x 10 6 活细胞/孔在200μl完全IMDM中，PMA，500ng / ml离子霉素和布雷菲德菌素A（1 / 1,000）。
  2. 在375 x g ，4℃下旋转5分钟并进行流式细胞术染色。
  流式细胞仪染色
  1. 将细胞在100μl含有0.3μl活/死可固定死细胞染色剂的1x PBS中孵育，每孔加入5μl小鼠BD Fc嵌段，在黑暗中于4°C孵育25分钟。
  2. 每孔用100μl1xPBS洗涤并在375 x g 下旋转5分钟。
  表面染色：
  1. 将细胞悬浮液与0.2μg抗小鼠缀合的抗体（即，CD45，CD3，CD4）在每孔100μlBD染色缓冲液中孵育25分钟，在黑暗中进行25分钟。
  2. 用100μlBD染色缓冲液洗涤并在375 x g 下旋转5分钟。
  用于细胞内染色：
  1. 将细胞悬浮液重悬于100μl1xFix / perm缓冲液（BD）中，并在4℃下在黑暗中孵育45分钟。
  2. 用1x Perm /洗涤缓冲液洗涤并在375 x g 下旋转5分钟。
  3. 将细胞悬浮液与0.2μg抗小鼠缀合的抗体（即，RORγt，IL-22）在每孔100μl的1x Perm / Wash缓冲液中孵育45分钟，在黑暗中于4℃孵育45分钟。
  4. 用1x Perm /洗涤缓冲液洗涤并在375 x g 下旋转5分钟。＆nbsp;
  5. 将细胞重悬于300μl的1x Perm / Wash缓冲液中。使用流式细胞仪分析和获取数据（我们使用来自BD的LSRII流式细胞仪并分析FlowJo上的数据）。样品可以在4°C的黑暗中储存过夜。
    
    图3.结肠组织的制备。：一种。必须从结肠中除去附着的脂肪组织（此处用箭头表示），因为脂肪会降低分离的结肠固有层的活力。 B. Taqman取样：将结肠与盲肠分开，通过去除所有脂肪和结缔组织，从宿主中仔细解剖。从近端（盲肠）端切下结肠，沿中线向下切直到远端。将纸巾弄平，切成2-3厘米的条状（粉红色方形），并立即用液氮中的聚丙烯管快速冷冻。

数据分析

病理学家根据三个标准对组织进行疾病严重程度评分（每个标准评分为0至3,0分=阴性，1 =轻度，2 =中度，3 =严重）：
炎症：当存在的特征在于大量（60％-70％）的单核细胞（巨噬细胞和淋巴细胞）和30％-40％的中性粒细胞和带状细胞的浸润。炎症的评分包括浸润的严重程度，腺体的损失，腺体腔的侵蚀和扩张，隐窝脓肿的存在和上皮细胞的退化。
细胞凋亡：凋亡小体的患病率评分为0-3：0 =阴性; 1 =低; 2 =中等; 3 =高。
再生：评估的再生变化包括评估粘膜上1/3中有丝分裂象的流行程度，个体腺体结构内的核密度（核拥挤），表面上皮的规律性。再生评分为0-3：0 =阴性; 1 =低; 2 =中等; 3 =高。
对于基因表达谱，平均来自同种型的标准化值
使用以下公式计算同种型对照的倍数变化：

倍数变化=（样品的标准化值）/（同种型对照组的平均标准化值）
对于流式细胞术分析，获得至少5×10 5个结肠固有层细胞
1. 事件在FSC-A和SSC-A上进行门控，然后在FSC-A和FSC-H上进行门控以去除双峰。
2. 排除细胞碎片和死细胞（使用LIVE / DEAD可固定染色剂）。
3. 为了研究浸润性免疫细胞的表型，在CD45 + 细胞上进行门控。
4. 用于分析产生IL-22的ILC3，活细胞上的门，谱系（CD11c，CD11b，NK1.1） - ，CD90.2 high ，CD45 int ，RORγt + ，IL-22 + 细胞。有关更多详细信息，可以在之前的出版物中找到门控策略（Bauche et al。，2018）。
使用Prism 7进行统计分析。未配对的 t - 测试用作统计测试。 P 值＆lt; 0.05被认为具有统计学意义。

食谱

1.上皮细胞解离解决方案
1x HBSS
青霉素/链霉素（1,000 U / ml）
5 mM EDTA
10mM HEPES
酶消化混合物
1x HBSS
青霉素/链霉素（1,000 U / ml）
10％FBS
2 mg / ml VIII型胶原酶
30 U / ml的DNase I
50 U / ml的Dispase
或者，当通过FACS分析时，1mg / ml的胶原酶D（Sigma）可用于保存细胞表面分子
完整的IMDM媒体，500毫升
450毫升IMDM，GlutaMAX补充剂
1,000 U / ml的青霉素/链霉素
1 mM丙酮酸钠
0.55mM的2-巯基乙醇
50毫升热灭活FBS

致谢

我们要感谢Gil Asio和Danye Cheng处理结肠样本。我们感谢Lakshmanan Annamalai和Jennifer H. Yearley在分析和评分组织学样本方面的专业知识。 Wendy Blumenschein和Jeff Grein用于运行基因表达谱。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

伦理

将小鼠维持在无特定病原体的条件下，并在Merck Research Laboratories（MRL）动物设施Palo Alto中用过滤水保持在微型隔离器中。所有动物程序均由MRL的机构动物护理和使用委员会根据实验动物护理评估和认证协会（AALAC）的指导批准。

参考

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Cayatte，C.，Joyce-Shaikh，B.，Vega，F.，Boniface，K.，Grein，J.，Murphy，E.，Blumenschein，WM，Chen，S.，Malinao，MC，Basham，B.， Pierce，RH，Bowman，EP，McKenzie，BS，Elson，CO，Faubion，WA，Malefyt Rde，W.，Kastelein，RA，Cua，D.，McClanahan，TK and Beaumont，M。（2012）。炎症性肠病中il-23途径治疗反应的生物标志物。 Clin Transl Gastroenterol 3：e10。
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Wang，C.，Yue，F。和Kuang，S。（2017）。使用免疫荧光染色，使用H＆amp; E染色和肌纤维类型分类进行肌肉组织学表征。 Bio -protoco l 7（10）：e2279。