材料和试剂

1.5 ml MaxyClear Microtubes（Axygen，目录号：MCT-150-C）
0.2 ml聚丙烯PCR管（Axygen，目录号：PCR-0208-C）
移液器吸头（Corning，Axygen ®）
0.22μmMillipore过滤器（Biosharp，BS-QT-011）
培养皿
Drosophila 系列（Tinghua Fly Center， http://fly.redbux.cn/ ）
1. y [1] sc [1] v [1] p {y [+ t7.7]} = nos-phiC31 \ int.NLS} X; P {y [+ t7.7] = CaryP} attP40 （TB00016）
2. y [1] sc [1] v [1] p {y [+ t7.7]} = nos-phiC31 \ int.NLS} X; P {y [+ t7.7] = CaryP} attP2 （TB00018）
3. y [1] sc [1] v [1]; wg [Gla-1] Bc [1] / CyO （TB00023）
4. y [1] sc [1] v [1];博士[1] e [1] / TM3，Sb [1] （TB00139）
5. y [1] sc [1] v [1] （TB00077）
pNP载体（氨苄青霉素抗性，质粒图谱如图1所示。此载体不是商业化的，但可以免费提供。如果需要，请发送电子邮件至 nijq@mail.tsinghua.edu.cn ）

图1. pNP构建图。 Vermilion是一个可选择的标记。 attB序列用于基因组attP着陆点的phiC31靶向整合。 MCS1允许在两个方向上克隆单个shRNA，而在MCS2和连接子的帮助下，它可以同时产生多个shRNA。
EcoRI-HF（NEB，目录号：R3101L）
NheI-HF（NEB，目录号：R3131L）
SpeI（NEB，目录号：R3133L）
XbaI（NEB，目录号：R0145L）
碱性磷酸酶，小牛肠道（CIP，NEB，目录号：M0290S）
AxyPrep TM DNA凝胶提取试剂盒（Corning，Axygen，目录号：AP-GX-250）
T4 DNA连接酶（NEB，目录号：M0202L）
Trans5α化学感受态细胞（Transgen Biotech，目录号：CD201-01）
Go Tag Green Master Mix，2x（Promega，目录号：000179370）
AxyPrep TM Plasmid Miniprep Kit（Corning，Axygen，目录号：AP-MN-P-250）
PurePlasmid Mini Kit（CWBiotech，目录号：CW0500M）
引物序列：
U-F：5'-GCTGAGAGCATCAGTTGTGA-3'; Ftz：5'-TAATCGTGTGTGATGCCTACC-3'
Buffer PB（QIAGEN，目录号：154051779）＆nbsp;
LB Broth，Miller（Luria Bertani）（Becton Dickinson）
琼脂（Beyotime）
氨苄青霉素（Solarbio，目录号：A8180）
Tris-HCl（AMRESCO，目录号：1185-53-1）
EDTA（AMRESCO，目录号：60-00-4）
NaCl（AMRESCO，目录号：7647-14-5）
KCl（AMRESCO，目录号：7447-40-7）
溴化乙锭（Sigma，目录号：E8751）
50x TAE（双螺旋，目录号：P0309A）
磷酸钠缓冲储备液（pH 6.8）（见食谱）
10x退火缓冲液（见食谱）
注射缓冲液（见食谱）
LB（Luria Bertani）中等（见食谱）
LB /氨苄青霉素板（见食谱）
1x TAE（见食谱）
1.5％琼脂糖凝胶（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf）
微波炉（三洋，型号：EM-2509EB1）
高压灭菌器（三洋，型号：MLS-3780）
PCR热循环仪（Eppendorf，Mastercycler nexus GSX1）
冷藏离心机（Eppendorf，型号：5417R）
立体显微镜（奥林巴斯公司）
NanoDrop 2000（Thermo Scientific）

软件

DSIR网站： http://biodev.cea.fr/DSIR/DSIR.html
FlyBase网站： http://flybase.org/
EMBOSS针： https://www.ebi.ac.uk/Tools/ PSA / emboss_needle / nucleotide.html
清华飞行中心： http://fly.redbux.cn

程序

矢量建筑
1. 单发短发构造
  1. 短发夹设计
    在 http://biodev.cea.fr/DSIR/DSIR上设计短发夹（21 nt）的引物.html 网站：首先，复制基因内的外显子序列，然后粘贴序列以使用此网络工具预测siRNA。基于我们定义的参数（图2），将选择具有最高分数的siRNA。为了避免脱靶效应，使用BLAST比较siRNA与FlyBase网站的苍蝇基因组（ http://flybase.org/ ）确保21 nt序列具有超过5 nt与其他基因不匹配的序列。 “作为re-com”序列是短发夹的有义序列。 “As”序列是短发夹的反义序列。
    Primer-F：ctagcagt“as re-com”tagttatattcaagcata“As”gcg
    Primer-R：aattcgc“as re-com”tatgcttgaatataacta“As”actg
    
    图2.短发夹设计的参数
  2. 退火
    如下进行退火反应，然后将Eppendorf管放入PCR设备中。将引物在95°C下变性5分钟，然后关闭PCR设备的电源，让其缓慢冷却至室温。
  3. 消化
    使用EcoRI / NheI限制性内切核酸酶进行pNP载体（图1）消化，然后用1.5％琼脂糖凝胶分离片段。用AxyPrep TM DNA凝胶提取试剂盒切割并纯化大约8,000bp的较大DNA片段。如下进行消化反应：
  4. 结扎
    使用T4 DNA连接酶用退火产物连接线性化的pNP载体。如下进行连接反应：
    
    混合并在25℃下孵育20分钟，然后按照标准方案将2-5μl连接产物加入10μlTrans5α化学感受态细胞中，并涂布在含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。将板在37°C孵育过夜，颠倒。
  5. 选择正确的克隆
    1. 标记并挑选PCR混合物的克隆。引物序列是U-F：5'-GCTGAGAGCATCAGTTGTGA-3'，Ftz：5'-TAATCGTGTGTGATGCCTACC-3'。
    2. 按如下方式设置和运行PCR程序：＆nbsp;
    3. 根据PCR产物的大小确定正确的克隆。通过凝胶电泳，正确的克隆产生约750bp的条带，错误的克隆出现1,000bp或无条带。
    4. 扩增正确的克隆：将正确的克隆装入5ml含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃，250rpm下孵育过夜。
    5. 使用AxyPrep TM 质粒Miniprep试剂盒提取质粒，并通过用引物（U-F：5'-GCTGAGAGCATCAGTTGTGA-3'）进行DNA测序进一步确认正确的克隆。
2. 在一个载体中构建多个shRNA
  1. 对于一个载体中的两个或更多个短发夹，我们首先将所有短发夹分别克隆到pNP载体中，如上所述。
  2. 使用SpeI在37℃下将载体pNP-shRNA1线性化90分钟，如下：
    
    在凝胶电泳前，使用CIP处理切割产品，在37°C下进行10分钟的去磷酸化，如下所示：
    
    使用AxyPrep TM DNA凝胶提取试剂盒纯化产物。
  3. 使用SpeI和XbaI消化另一个发夹载体，释放含有不同短发夹的片段（300 bp），如下所示：
    
    将消化的产物分离在琼脂糖凝胶上，用AxyPrep TM DNA凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中提取约300bp的较小DNA片段。最后，使用T4 DNA连接酶将线性化的pNP-shRNA1与释放的片段（shRNA2）连接。＆nbsp;
  4. 转化后，使用引物（U-F：5'-GCTGAGAGCATCAGTTGTGA-3'，Ftz：5'-TAATCGTGTGTGATGCCTACC-3'）通过PCR鉴定正确的克隆，其产生约1,000bp。然后通过DNA测序进一步确认这些正确的质粒。
  5. 为了克隆第三shRNA，将含有两个shRNA的载体再次用SpeI消化，然后通过SpeI和XbaI消化与发夹载体释放的另一个短发夹片段连接。
纯化并注射正确的pNP-shRNA载体
1. 纯化质粒DNA
  按照制造商的说明，使用PurePlasmid Mini Kit提取质粒DNA（~10 mg）。用70μl1x注射缓冲液洗脱质粒DNA。每种样品的适当浓度为100-200mg / ml，其通过使用NanoDrop 2000测定。
2. 向苍蝇注射质粒DNA
  按照标准方案（Ni et al。，2011）将纯化的质粒DNA注射到果蝇（染色体II TB00016;染色体III TB00018）中。为了敲除第二条染色体上的基因，选择TB00016进行显微注射，而选择第三条染色体上的基因选择TB00018。将注射的胚胎保持在25°C和60％湿度至成人（G0）。
3. G0羽化后的选择方案（图3和图4是筛选程序的概述）
  1. 一旦G0苍蝇开始孵化成成虫，将它们交叉到TB00077（朱红色的眼睛颜色）。
    注意：对于y，v股票的注入，G0应该都有朱红色的眼睛。
  图3.产生染色体II转基因果蝇的选择程序概述
  1. 当成年G1蝇开始闭合时，筛选G1转化体。请记住，pNP载体携带 vermillion （ v + ）的副本，因此G1转化体将具有深红色野生型（ v + ）眼睛颜色。
  2. 将适当的平衡剂原种与来自♂G0亲本的♂G1转化体杂交（对于染色体II整合到attP40位点，G1蝇与TB00023杂交。对于染色体III整合到attP2位点，G1蝇与TB00139杂交）。当G2苍蝇开始闭合时，收集具有 v + （野生型）眼睛颜色和CyO（对于染色体II）的♂和处女♀兄弟姐妹插入）或TM3（用于染色体III插入），并且彼此交叉兄弟以筛选纯合的转基因果蝇。收集♂G3和处女♀G3兄弟姐妹，并互相交叉兄弟姐妹，以确保纯合的转基因果蝇是可育的。
  3. ♂来自♀G0父母的转化体需要再次回交TB00077以去除phiC31整合酶。收集野生型（ v + ）眼睛颜色♂G2转化体以穿过适当的平衡器种群。以下顺序步骤与步骤B3c一致。
  图4.产生染色体III转基因果蝇的选择程序概述

数据分析

EMBOSS针（ https://www.ebi.ac.uk/Tools/ psa / emboss_needle / nucleotide.html ）用于序列比对。有关本手册数据的详细信息，可在合理要求下从相应作者处获得。

食谱

10x退火缓冲液（在RT存储）
注射缓冲液
在无菌双蒸水中制备1 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.8）和50 mM KCl，然后通过0.22μmMillipore过滤器过滤，储存于-20°C
磷酸钠缓冲液（pH 6.8）（原液）
51ml 0.2M NaH 2 PO 4
49ml 0.2M Na 2 HPO 4
在室温下储存
1. 0.2 M Na 2 HPO 4
  在1L ddH 2 O中溶解71.6g Na 2 HPO 4 •12H 2 O，充分混合< br /> 在室温下储存
2. 0.2M NaH 2 PO 4
  在1L ddH 2 O中溶解31.2g Na 2 HPO 4 •2H 2 O，充分混合< br /> 在室温下储存
LB（Luria Bertani）中等
将25g粉末溶于1L ddH 2 O中，充分混合
在121℃下高压灭菌15分钟
LB /氨苄青霉素板
在1升ddH 2 O中加入25克LB培养基和7克琼脂。在121°C高压灭菌15分钟
灭菌后，让培养基冷却，然后加入100μg/ ml的氨苄青霉素，将15ml培养基倒入每个培养皿中
1x TAE
20毫升50倍TAE
980 ml ddH 2 O
在室温下储存
1.5％琼脂糖凝胶
1.5克琼脂糖
100毫升1x TAE
加热溶液以在微波炉中溶解琼脂糖
加入溴化乙锭至终浓度为0.2μg/ ml

致谢

这项工作得到了中华人民共和国科学技术部国家重点技术研究发展计划（2016YFE0113700）和国家自然科学基金（31571320,91729301,81630103）和国家科学部的支持。杰出青年学者基金（31725023）。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

参考

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Ni，JQ，Zhou，R.，Czech，B.，Liu，LP，Holderbaum，L.，Yang-Zhou，D.，Shim，HS，Tao，R.，Handler，D.，Karpowicz，P.，Binari ，R.，Booker，M.，Brennecke，J.，Perkins，LA，Hannon，GJ和Perrimon，N。（2011）。在果蝇中转基因RNAi的基因组规模shRNA资源。 Nat方法 8（5）：405-407。
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