材料和试剂

PCR管
1.5毫升Eppendorf管
15毫升试管
塑料培养皿（直径9厘米）用于细菌生长
无菌环（1μl）
移液器吸头
250毫升电子烧瓶
50毫升塑料管
电穿孔比色皿，1 mm间隙（BTX，产品编号：45-0124）＆nbsp;
Salmonella enterica 血清型鼠伤寒沙门氏菌LT2（生物安全等级2）
结合盒插入位点外部的PCR引物
氨苄西林（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
葡萄糖（西格玛奥德里奇，目录号：G7021）
细菌琼脂（Oxoid，目录号：LP0011）
乙醇（95％）
PCR Master Mix（2x）（Thermo Fisher，目录号：K0171）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84100）
胰蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0042）
酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
LB培养基（见食谱）
洛杉矶板块（见食谱）
无盐LA + 5％蔗糖（见食谱）

设备

试管架
高压灭菌器
培养箱温度为37°C
PCR机
移液器（10μl，20μl，100μl和1,000μl）
在37°C摇动培养箱
紫外透射仪（例如，365 nm）
在30°C摇动培养箱
在43°C摇水浴
50 ml试管的离心机（温度控制）（Thermo Scientific，型号：Haraeus Megafuge 16R）
Eppendorf管的离心机（温度控制）（Eppendorf，型号：Centrifuge 5424R）
Electroporator（Bio-Rad，型号：Gene Pulser Xcell）

程序

将基因盒插入染色体位置，确定重组率
注意：此步骤特定于测量重组率的每个位置。该程序的细节也将根据使用的Lambda-red重组系统而变化。有关Lambda-red重组工程的详细说明，请参阅Yu et al。，2000。以下步骤是基于pSIM6的重组工程的总结。
1. 通过PCR扩增 cat - sacB - yfp 盒并纯化产品。
  注意：引物设计和扩增条件特定于使用的可选择/可反选择的盒和插入位置，因此在本协议中不再进一步描述。
2. 开始过夜培养：在含有来自单个菌落的细胞的15ml试管中接种含有100mg / L氨苄青霉素的2ml无菌LB。
3. 在30℃的培养箱中孵育，以200rpm摇动约20小时。
4. 在250ml E-烧瓶中将含有100mg / L氨苄青霉素和0.2％葡萄糖的50ml无盐LB与500μl/ ml培养物混合。
5. 在30°C的培养箱中孵育，以200 rpm的速度振荡~2 h。
6. 为了诱导红色表达，将烧瓶移至43℃振荡水浴中15分钟。
7. 在冰水浴中冷却至少10分钟。小心旋转以冷却细胞。
8. 将培养物转移到冷的50ml塑料管中并使细胞沉淀（3,500 x g ，8分钟，4℃）。
9. 尽可能多地去除上清液，并将细胞重悬于20ml冰冷的无菌水中。不要涡旋！在3,500 x g ，8分钟，4℃下沉淀细胞。
10. 将细胞重悬于1ml冰冷水中，转移至冷的Eppendorf管中。将细胞在16,000 x g ，3分钟，4℃下沉淀，并尽可能多地除去上清液。
11. 将细胞重悬于100μl冰冷水中。
12. 将50μl细胞与5μl纯化的PCR产物混合，在冰上孵育5分钟并转移到冷的电穿孔杯中。＆nbsp;
13. 电镀（1.8 kV，200Ω，25μF）。立即将细胞重悬于1ml预热（37℃）的LB中，然后转移回Eppendorf管中。
14. 让细胞恢复至少3小时或在37℃下过夜。
15. 在含有25mg / L氯霉素的LA平板上平板100μl回收的培养物，在37℃下孵育平板。
16. 在含有25mg / L氯霉素的LA平板上重新划线菌落，将平板在37℃下孵育o / n。
17. 通过PCR大小验证确认正确插入并测试重组细胞的表型（YFP荧光和对含有5％蔗糖的无盐LA平板上生长的敏感性）。
确定每毫升过夜培养物的菌落形成单位数
1. 对待测量的每个菌株开始三个独立的过夜培养物：在15ml试管中接种2ml无菌LB，其中来自单个菌落的细胞。
2. 在37℃的培养箱中孵育，以200rpm摇动约20小时。
3. 在无菌0.9％NaCl溶液中制备10倍稀释系列至稀释因子10 -7 。
4. 在LA平板上铺板100μl稀释液10 -5 ，10 -6 和10 -7 。
  注意：在这些孵化条件下培养物通常会长到大约4 x 10 9 cfu / ml。改变形成不同密度培养物的菌株或条件的平板稀释因子。
5. 将LA平板在37℃的培养箱中孵育约20小时。
6. 计算每个板块的菌落数。选择每板30-500菌落稀释，根据公式1计算原始培养密度（参见数据分析）。＆nbsp;
确定待测试的过夜培养物的体积
注意：步骤B1-B3与“程序A”相同，两个部分可以使用相同的稀释液。
1. 对待测量的每个菌株开始三个独立的过夜培养物：在15ml试管中接种2ml无菌LB，其中来自单个菌落的细胞。
2. 在37℃的培养箱中孵育，以200rpm摇动约20小时。
3. 在无菌0.9％NaCl溶液中制备10倍稀释系列至稀释因子10 -5 。
4. 在含有5％蔗糖的无盐LA平板上平板100μl每种稀释液（10 0 至10 -5 ）。
5. 在37°C的培养箱中孵育约20小时。
6. 在紫外光下评估菌落的荧光。将非荧光菌落重新划线到含有5％蔗糖的无盐LA平板上。
  注意：使用波长不会导致DNA损伤的紫外线（例如，365 nm），每个菌落形态重新划线两个菌落（不同的菌落形状）或大小）如果超过5个菌落是非荧光的。
7. 在37°C的培养箱中孵育约20小时。
8. 通过PCR大小验证然后对插入位点进行测序，确认重组去除 cat - sacB - yfp 盒。
9. 估计稀释因子，其中大约一半的培养物将产生菌落，重组移除 cat - sacB - yfp 盒。
  注意：估计的稀释度不需要是10倍稀释系列的一部分，但可以是任何稀释度。
测量重组率
1. 对待测量的每个菌株开始20个独立的过夜培养物：在15ml试管中接种2ml无菌LB，其中来自单个菌落的细胞。
2. 在37℃的培养箱中孵育，以200rpm摇动约20小时。
3. 按照“方法B”中的测定，在无菌的0.9％NaCl溶液中进行适当的稀释。
4. 在含有5％蔗糖的无盐LA平板上铺板100μl每种稀释液。
5. 在37°C的培养箱中孵育约20小时。
6. 在紫外光下评估菌落的荧光。将非荧光菌落重新划线到含有5％蔗糖的无盐LA平板上。
  注意：使用波长不会造成DNA损伤的紫外线（例如，365 nm）。如果超过5个菌落是非荧光的，则每个菌落形态（不同的菌落形状或大小）重新划线两个菌落。
7. 在37°C的培养箱中孵育约20小时。
8. 通过PCR大小验证然后对插入位点进行测序，确认重组去除 cat - sacB - yfp 盒。
9. 根据公式2计算重组率（参见数据分析）。＆nbsp;

数据分析

培养密度根据公式计算：
P = N / V * D＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆nbsp;（1）
其中P是以cfu / ml计的种群密度，N是平板上的菌落数，V是以ml计的体积，D是稀释因子。
重组率根据公式计算：
μ= -ln（P 0 ）/ N＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆nbsp;（2）
其中μ是突变率，P 0 是没有重组去除 cat - sacB - yfp的培养物的比例盒和N是用于测定的细胞数。

笔记

该方案可以在可以使用λ-red重组工程的任何细菌菌株中进行。
编写此协议是为了使用 cat - sacB - yfp 盒式磁带（可根据要求提供），但任何可选择/可选择的盒式磁带和筛选标记可以使用。

食谱

LB媒体
混合和高压灭菌：
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
10克氯化钠（省略无盐LB）
1升水
洛杉矶板块
混合和高压灭菌：
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
10克氯化钠
15克琼脂
1升水
将培养基倒入塑料培养皿中并固化
无盐LA + 5％蔗糖
1. 混合和高压灭菌
  10克胰蛋白胨
  5克酵母提取物
  15克琼脂
  700毫升水
2. 混合和高压灭菌
  50克蔗糖
  300毫升水
3. 混合两种溶液，将培养基倒入塑料培养皿中并固化

致谢

这项工作得到了瑞典科学研究委员会（Vetenskapsrådet，资助号2016-04449,2017-03953）和Carl Trygger基金会（授权号CTS16：194，CTS17：204）的资助。

利益争夺

作者没有利益冲突。

参考

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Gay，P.，Le Coq，D.，Steinmetz，M.，Berkelman，T。和Kado，C.I。（1985）。在革兰氏阴性菌中诱捕插入序列元素的阳性选择程序。 J Bacteriol 164（2）：918-921。
Hughes，D。（2000）。 tuf 基因的共同进化将基因转换与生成染色体倒位。 J Mol Biol 297（2）：355-364。
Segall，A.M。和Roth J.R.（1989）。沙门氏菌染色体中直接和反向同源性的重组：不允许反转形成的间隔。 Genetics 122（4）：737-747。
Thomas，C。M.和Nielsen，K。M.（2005）。细菌间水平基因转移的机制和障碍。 Nat Rev Microbiol 3（9）：711-721。
Yu，D.，Ellis，H.M.，Lee，E.C.，Jenkins，N.A。，Copeland，N.G。和Court，D.L。（2000）。 Escherichia coli 中染色体工程的有效重组系统。 Proc Natl Acad Sci USA 97（11）：5978-5983。