材料和试剂

老年C57Bl / 6雄性小鼠（24个月大），模拟56-69岁的人类（Flurkey et al。，2007）
注意：
1. 与其他染色相比，已经观察到行为C57Bl / 6小鼠的差异（Crabbe 等，1999）。此外，行为测试中的性别差异也已在文献中广泛描述（Kopp et al。，2006）。
2. 为了测试自发交替的y-迷宫，动物可以维持标准小鼠食物和水的饮食。将小鼠保持在规律的光照周期。
表面消毒剂，一种表面消毒剂，用于去除动物之间的迷宫上的气味（例如，70％乙醇）
注意：在选择消毒剂时，应参考文献，以确定哪种溶液适合于正在测试的小鼠品系（Campagna et al。，2016）和正在使用的设备。 < br />

设备

Y-maze（定制或商业购买）（Stoelting，目录号：60180），y-maze可由灰色，白色或黑色有机玻璃制成，尺寸为39.5 x 8.5 x 13 cm（图1A）< br /> 注意：塑料纤维使动物之间的消毒变得容易，以消除任何气味。迷宫的三个臂以120°的角度相互连接。在测试之前，动物应该习惯于室内至少30分钟，而不会看到迷宫。
摄像机
注意：
1. 可以使用摄像机录像，实时分析或自动跟踪设备（如AnyMaze（Stoelting，目录号：60000））跟踪动物行为。对于摄像机录像，不需要特殊的帧速率。＆nbsp;
2. 我们的视频记录了所有动物，这些动物通过对实验组不知情的两个人进行评分。设置应该高于y-maze并且不会干扰测试，如图1B所示。
视觉提示
注意：纸质视觉提示可以定制并悬挂在测试室的墙壁上。这些提示应该是均匀的颜色，例子如图1B所示。

图1.自发交替y-maze装置（A）和测试装置（B）的图示

软件

动物追踪计划，AnyMaze（Stoelting，目录号：60000）
统计测试，GraphPad Prism（GraphPad软件）

程序

注意：进行本协议中描述的实验需要获得机构动物伦理协议批准。

Habituate老鼠处理
在测试y-maze之前至少一到两周，实验者应该从笼中移除动物并处理它们（Crawley，2007）。每周，动物应每天处理7天中的5天。每只小鼠应至少处理5分钟。
在y迷宫的那天，在开始行为测试之前30分钟习惯性地将动物测试到测试室（Rutkowsky 等人，，2018）。在测试之前，动物不应该能够看到y迷宫。
每天在同一时间进行行为测试。我们在下午的光照周期中测试了动物。在测试时间参数中保持一致非常重要。
如果可能的话，测试室中的灯可以调暗以增加测试期间对迷宫的探索。在y-迷宫的中心应该有间接和均匀照明（150-200勒克斯）。
将每只小鼠，幼稚放置在迷宫中，放在一只手臂的同一端，让每只小鼠在8分钟的时间内在迷宫中自由移动（Sarter et al。，1988; Maurice et al。，1994; Holcomb et al。，1998; Li et al。，2010; Lee et al。，2017; de Sousa et al。，2018）。视频记录整个过程。记录实验组不知情的两个人的手臂入口数。如果动物在多天内进行测试，那么y迷宫的方向应该每天都相同。
注意：
1. 如果在测试过程中有很大的噪音（例如，构造），可以使用白噪声机器。在测试之前，动物应该习惯于白噪声。在我们的研究中，我们在测试期间没有使用任何白噪声。
2. 可以对上述测试协议进行修改，这些修改总结在表1中 - 测试时间和范例的变化（Mihalick 等。，2003;Võikar et al。，2004; Tchantchou et al。，2005; Barakat et al。，2018）以及每只动物的试验次数（Mihalick 等。，2003）。其他修改包括对象识别（Romberg et al。，2013; Ibi et al。，2018）和两个试验的迷宫，评估短期记忆（Dellu 等。，2000）。以及评估短期记忆的两个试验的迷宫（Dellu 等。，2000）。在第一次试验中，一只手被阻塞，让小鼠仅探索迷宫的两个臂5分钟。在第二次试验中，在试验间隔60分钟后，移除第三臂的阻滞，小鼠能够探测所有三个臂5分钟。新手臂花费的时间是在第一分钟内计算的。
每次试验后，在放置下一只小鼠之前，应对y-迷宫进行清洁，消毒和干燥。或者，可以将锯屑或床上用品添加到y-迷宫中并在动物之间混合（Ma et al。，2007）。

表1.可以对自发交替y-maze测试协议和设备进行更改的摘要

数据分析

自发变更y-迷宫分析的三个主要输出是交替和条目的数量，以及交替百分比。可以基于臂条目的顺序计算交替的数量。交替定义为在重叠三联体组上连续进入3个臂（图2）。例如，进入第1,3和2组的条目被认为是交替。而进入第1,2和1组的条目不会被视为交替。交替可用于测量小鼠的短期空间记忆（Sarter et al。，1988）。当小鼠的后爪完全放在手臂中时，完成手臂进入（Ohno et al。，2004）。每个臂的条目数是测试期间活动和运动的度量，并且还用于计算交替百分比。交替百分比可以计算为实际与交替的比率，可以使用下面的公式计算：

％交替=（交替总数）/（输入的手臂数）×100％

图2.描绘交替的代表性图像。交替是连续进入y迷宫的每个臂而没有任何重复。对于每次交替，有三个步骤。在（A）步骤1进入第1组中概述的交替步骤; （B）第二步进入第3组;并在（C）第三步进入第2组。

老年小鼠缺乏动力可能是一个问题。在这种情况下，可以使用水（Lyon et al。，2011）或食物（Spence和Lippitt，1946）推动的y迷宫测试。在排除鼠标方面，如果鼠标继续跳出迷宫或在测试期间不移动，他们的行为可能会使它们成为异常值。在做出移除小鼠的决定之前，实验者应仔细检查数据。因此，我们建议所有试验都是录像。我们建议实验者不要对记忆缺陷做出过早的结论，直到进行了足够的参数研究并评估了其他解释，请参考表2中的建议。

表2.啮齿类动物自发交替y-maze任务的故障排除指南

可以使用GraphPad Prism 6.0或任何其他统计程序进行包括交替和条目的数量以及交替百分比的数据的统计分析。根据组的数量，可以使用未配对的 t - 测试或方差分析（ANOVA）。
＆NBSP;在图3中，我们提供了缺乏亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）的老年雄性C57Bl / 6小鼠的样品分析。所有动物都按行为任务进行，没有非表演者。我们使用GraphPad Prism 6.0进行统计分析。未配对的 t - 测试用于比较基因型组。在所有分析中， P ＆lt; 0.05被认为是显着的。所有数据表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。与野生型对照相比， Mthfr +/- 小鼠的改变较少[图3A，t（17）= 2.6， P ＆lt; 0.05]。似乎 Mthfr +/- 小鼠的总臂数较少，但这没有统计学差异[图3B，t（17）） = 1.1， P ＆gt; 0.05]。减少的手臂入口数量是减少活动的标志。当交换中考虑了臂条目的数量时， Mthfr +/- 小鼠的交替百分比仍然减少[图3C，t（17）= 2.39， P ≤0.05]。

图3.亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）缺乏对老年人自发交替y-迷宫的影响 Mthfr + / + 和 Mthfr +/- 雄性小鼠。交替次数（A），条目（B）和交替百分比（C）。每组8-9只小鼠的平均值±SEM。 *表示 P ＆lt; 0.05，未配对 t - 测试。

结论：使用这种自发交替的迷宫，我们能够测量老年动物的短期空间记忆。在小鼠中，空间识别记忆也可以通过T型迷宫，径向臂迷宫和巴恩斯迷宫任务进行评估，但与自发的迷宫相比，所有这些任务都需要大量训练（Crawley，2007）。此外，T迷宫和放射臂迷宫需要饮食限制，这对于老年小鼠可能是具有挑战性的。自发的迷宫使用啮齿动物的自然探索行为在初级水平上测量空间识别记忆。这种类型的记忆在老化研究中得到了一致的评估，因此是一项有价值的测试。 y迷宫不需要大量的输出资源或动物训练，因此评估老年动物并不困难。随着人口老龄化的增加（联合国经济和社会事务部，2013年）和与年龄有关的疾病的流行（Bach et al。，2011），迫切需要了解疾病过程与衰老和治疗发展有关。自发交替的迷宫为研究人员提供了关于记忆以及动物在短时间内探索活动的数据。此外，标准的迷宫是灵活的，可以适应测量空间和物体识别，以及使用2试验y迷宫的新颖探索。

致谢

这项研究得到了安大略省大学博士后女性健康学者奖学金和加拿大自然科学与工程研究委员会（N.M.J.）的支持。

利益争夺

没有冲突。

伦理

小鼠在卡尔顿大学科学系神经科学系培育和维持。在该研究中进行的所有实验均符合加拿大动物保护协会（CCAC）。将动物维持在标准小鼠食物和水的饮食中，以及随意的水。

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