材料和试剂

50毫升管（Thermo，目录号：339652）
15毫升管（Thermo，目录号：339650）
5毫升圆底管（Falcon，目录号：352054）
10厘米碟（猎鹰，目录号：353003）
6孔板（Costar，目录号：3516）
12孔板（Costar，目录号：3513）
26 G针（Terumo，目录号：NN-2613S）
10毫升注射器（Terumo，目录号：SS-10SZ）
Cryovial（Thermo，目录号：375418）
磨砂玻璃滑梯（Matsunami，目录号：S2226）
MACS LS色谱柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
100μm网眼（TGK，目录号：N-No.200HD）
40μm网眼（TGK，目录号：N-No.355T）
40LB细胞：稳定表达小鼠CD40L和小鼠BAFF的BALB / c3T3细胞（由RIKEN BRC提供）（Nojima et al。，2011）
D-MEM（高葡萄糖，WAKO，目录号：044-29765）
胎牛血清（FBS，见注释）
胰蛋白酶-EDTA（WAKO，目录号：204-16935）
青霉素 - 链霉素（Gibco，目录号：15140-122）
RPMI-1640（WAKO，目录号：189-02025）
HEPES（Dojindo，目录号：346-08235）
2-巯基乙醇（2-ME，Gibco，目录号：21985-023）
NaCl（WAKO，目录号：195-01663）
KCl（WAKO，目录号：163-03545）
Na 2 HPO 4 （WAKO，目录号：196-02835）
KH 2 PO 4 （WAKO，目录号：169-04245）
EDTA（Dojindo，目录号：345-01865）
生物素化的抗CD43（BD Pharmingen，克隆：S7，目录号：553269）
生物素化抗Ter119（Biolegend，克隆：TER-119，目录号：116204）
生物素化抗CD4（Biolegend，克隆：GK1.5，目录号：100404）
生物素化抗CD8（Biolegend，克隆：53-6.7，目录号：100704）
生物素化的抗CD49b（Biolegend，克隆：DX5，目录号：108904）
生物素化的抗H-2K d （Biolegend，克隆：SF1-1.1，目录号：116604）
生物素化抗CD138（Biolegend，克隆：281-2，目录号：142512）
Streptavidin Particles Plus-DM（BD，IMag，目录号：557812）
重组小鼠IL-4（PeproTech，目录号：214-14）
重组小鼠IL-21（PeproTech，目录号：210-21）
3T3培养基（见食谱）
B细胞培养基（BCM）（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
MACS缓冲区（参见食谱）
用于B细胞分离的抗体混合物（一个脾脏）（见食谱）
用于饲养细胞耗竭的抗体混合物（用于细胞）（参见食谱）

设备

移液器
高压灭菌器
37°C水浴
CO 2 培养箱（Panasonic，目录号：MCO-170AIC-PJ）
层流罩（SANYO，生物洁净工作台）
Frosty先生（Thermo，目录号：5100-0001）
-80°C冰箱
液氮储罐
细胞分离磁铁（BD IMag，目录号：552311）
离心机（Kubota，4000,5911,6200）
MACS MultiStand（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）
MidiMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-302）

程序

实验程序的示意图如图1所示。

图1. iGB细胞培养系统程序的示意图

40LB细胞的繁殖和40LB细胞饲养层的制备
通常在37℃，5％CO 2 的10cm培养皿中培养并维持40LB饲养细胞和10ml 3T3培养基。如下所述，每3天将40LB细胞以6倍稀释度传代并保持培养长达一个月。大约一个月后，从冷冻库存重新开始培养。以下方案用于使用10cm培养皿的培养。如表1中的示例所示，使用与板（井）底部区域成比例的方式更改溶液的体积，如表1中的示例所示。
1. 解冻冷冻的1 ml 40LB细胞原液，用12 ml 3T3培养基稀释内容物（参见食谱）。
2. 将细胞在270℃下离心5分钟，在4℃下离心5分钟。
3. 弃去上清液，通过移液将细胞重悬于10ml 3T3培养基中，并将所有细胞接种到10cm培养皿中。
4. 在37℃，5％CO 2 培养细胞1-2天，直至它们达到70％-80％汇合。
5. 从培养皿中取出培养基，用2 ml PBS冲洗（参见食谱）。
6. 弃去PBS，加入1ml胰蛋白酶-EDTA，将培养皿置于室温下直至细胞分散（约需1-3分钟）。
7. 加入3毫升3T3培养基，轻轻上下移液，完全分离细胞。
8. 将细胞悬浮液转移到管中，并在4℃下以270×g离心5分钟离心。
9. 弃去上清液，将细胞重悬于所需体积的3T3培养基中。
10. 为了传代，将细胞悬浮液从步骤A9稀释6倍，将细胞接种到10cm培养皿和37℃，5％CO 2 的培养细胞中3天。
11. 对于辐射，将适当数量的来自步骤A9的40LB细胞接种到所需的板（参见表1），并使细胞至少12小时附着板。或者，将收获的40LB细胞在管中照射，然后将它们接种到平板上，并将它们培养至少12小时，直到40LB细胞附着到平板上并完全展开。
12. 用80Gy的γ射线照射细胞以阻止增殖。
13. 对于细胞原液，将来自步骤A9的细胞沉淀重悬于冰冷的20％FBS和10％DMSO（每毫升~2×10 6 细胞）中，向每个冷冻管中加入1ml细胞悬浮液，将小瓶放入Frosty先生，然后将细胞置于-80°C深度冷冻箱中24小时。 24小时后，将小瓶转移到液氮储罐中。
  
  表1.平板类型，种子细胞数和溶液体积
从小鼠脾脏中分离和纯化用于iGB细胞培养的B细胞将细胞保持在冰上或4°C，并使用预冷溶液。以下是一个脾脏的协议。
1. 从C57BL / 6小鼠取脾脏，将脾脏放入10厘米的培养皿中。
2. 使用26G针头和10ml注射器在脾脏内注入10ml MACS缓冲液（参见食谱），以提取脾细胞，然后使用一对磨砂玻璃载玻片轻轻破坏剩余的脾脏囊。
3. 用移液管将细胞悬浮液通过100μm筛网转移到管中。
4. 在370 x g 离心6分钟。
5. 弃去上清液，用10ml MACS缓冲液重悬细胞并计数细胞数。
6. 弃去上清液，每10个 8 细胞加入100μl抗体混合物用于B细胞分离（参见配方），并轻轻地上下移液以完全悬浮细胞。
7. 在冰上孵育20分钟。
8. 在每个步骤中通过加入10ml MACS缓冲液并离心（370 x g 6分钟）洗涤细胞两次。
9. 弃去上清液，每10 8 细胞加入50μl链霉抗生物素蛋白颗粒Plus-DM，轻轻上下移液以完全悬浮细胞。
10. 将细胞在冰上孵育20分钟。
11. 将两个5ml圆底管放在IMag细胞分离磁铁上。
12. 用2ml MACS缓冲液重悬细胞并转移到磁体上的第一个管中。
13. 等待5分钟，直到标记的细胞附着在磁铁旁边的管壁上。
14. 从第一个管中收集未结合的细胞并将其转移到第二个管中。
15. 分离第一个试管，用新的2 ml MACS缓冲液将附着的细胞重新悬浮在第一个试管中，然后将试管放回磁铁上并保持5分钟。
16. 从第二个管中收集未结合的细胞并将其转移到收集管中。
17. 再次重复步骤B13-B15。
18. 从第一个管中收集未结合的细胞，将其转移到第二个管中并保持5分钟。
19. 从第二个管中收集未结合的细胞并将其转移到收集管中。
20. 将收集的全部细胞在370℃下离心6分钟。
21. 将LS柱放在与MACS MultiStand连接的MidiMACS分离器上，并将40μm网孔放在LS柱的顶部。
22. 用2 ml MACS缓冲液冲洗色谱柱。
23. 弃去步骤B19的上清液，用1ml MACS缓冲液重悬细胞。
24. 通过40μm筛网将细胞悬浮液施加到LS柱上，并使所有悬浮液通过柱。
25. 每次用1ml MACS缓冲液洗涤柱3次。
26. 用3ml MACS缓冲液洗涤柱一次。
27. 收集所有流出物并在370 x g 下离心6分钟。
28. 弃去上清液，用10 ml B细胞培养基重新悬浮细胞（BCM，参见食谱）并计算细胞数。
  注意：来自一个脾的预期B细胞数是2 x 10 7 -5 x 10 7 细胞。
29. 使用流式细胞术检查分离的B细胞的纯度。使用荧光染料缀合的抗体对抗B细胞标记物如CD19和B220。 B细胞的纯度通常超过97％。
  注意：或者，使用MACS或FACS的阳性分选的B细胞可用于培养。也可以使用来自外周血或其他淋巴器官如淋巴结的B细胞。
iGB细胞培养
使用预热缓冲液和培养基。以下方案适用于使用10厘米培养皿的培养。
注意：B细胞开始增殖并成为'iGB细胞'后，iGB细胞应在室温下进行处理，如离心，抗体染色，iMag，MACS或流式细胞仪等.iGB细胞倾向于在冰上死去。
1. 从10cm培养皿中取出经辐照的饲养细胞的培养基，并加入35ml补充有IL-4的BCM（终浓度为1ng / ml）。
2. 加入5ml含有适当数量的分离的B细胞的BCM（见表1），并在37℃，5％CO 2 培养4天（图2）。
  
  图2.用IL-4培养4天后iGB细胞和40LB层的显色视野显微镜检查。 A和B. iGB细胞在饲养层上。（A）4倍放大率，（B）20倍放大率。 C.在80xG辐射下以4x放大率照射40LB饲养层。
3. 为了收获细胞，小心地将培养基从表面移除至底部上方约0.5cm的水平，并将剩余的培养基转移至收集管（剩余培养基的体积为约10ml）。
4. 加入4毫升MACS缓冲液，在室温下放置培养皿，直到细胞开始分散（大约需要3-5分钟）。＆nbsp;
5. 轻轻摇动培养皿以分离细胞并将其收集到管中。
6. 用5ml MACS缓冲液冲洗平板并将培养基收集到管中。再重复一次。
7. 将所有收集的细胞在370℃下在室温下离心5分钟。
8. 弃去上清液，轻轻摇动破坏细胞沉淀。用10ml B细胞培养基重悬细胞沉淀并计数细胞数。 iGB细胞可以区分为小于40LB细胞的细胞。
  注意：来自10厘米培养皿的预期iGB细胞数是2 x 10 7 -4 x 10 7 ，iGB细胞的存活率超过90％。
9. 为了顺序培养细胞，将适当数量的iGB细胞接种到新照射的饲养层上，并如步骤C1中所述用适当的细胞因子培养它们。
  注意：原始培养的iGB细胞可以在10 ng / ml IL-21（或IL-4促进进一步转换为IgE）的新饲养层上重新扩增，如原始文章中所述（Nojima et al。，2011）。为此，将包括饲养细胞的整个收获的细胞放在新的饲养层上，根据需要调整iGB细胞的数量。例如，第4天的原代iGB细胞可以接种，用IL-21培养，5×10 5 （另外3个）每10厘米培养皿中每天）或5×10 4 （再过4天）。在IL-21的二次培养中，iGB细胞的生长速度难以预测，因此当培养基开始变黄时会改变培养基。根据我们的经验，在二次培养期间iGB细胞的预期扩增因子是100-300倍（4天内），并且iGB细胞的存活率总是超过70％。二次培养可以持续至少6天而无需更换饲料。
饲养细胞耗尽
当将iGB细胞培养物的转染细胞转移到小鼠中或在分子水平上进行分析时，需要从iGB细胞培养物的收获细胞中除去饲养细胞。该耗尽方案适用于来自一个10cm培养皿的细胞。使用预热缓冲液和培养基。
1. 如步骤C3-C7中那样收获细胞。
2. 弃去上清液并轻轻摇动破坏细胞沉淀。添加260μl抗体混合物用于饲养细胞耗尽（参见食谱）并轻轻地上下移液以完全悬浮细胞。对于来自6孔或12孔板的1孔的细胞，分别使用相同浓度的1/6或1/12体积的稀释抗体。
3. 在室温下孵育20分钟。
4. 通过在每个步骤中加入10ml MACS缓冲液并在室温下离心（370 x g 5分钟）洗涤细胞两次。
5. 弃去上清液并轻轻摇动破坏细胞沉淀。加入50μl链霉抗生物素蛋白颗粒Plus-DM和100μlMACS缓冲液，然后轻轻上下移液以完全悬浮细胞。
6. 在室温下孵育20分钟。
7. 如步骤B10-B24所述，应用于iMag和MACS程序。
8. 收集所有流出物并在室温下以370 x g 离心5分钟。
9. 将收集的细胞重悬于10 ml适当的培养基或缓冲液中，计算细胞数。

笔记

需要进行FBS批次检查，因为FBS中的批次特异性差异会影响细胞生长，类别转换和iGB细胞的生成。实际上，我们测试的批次中只有约30％运作良好。当我们选择用于iGB细胞培养的FBS批次时，我们通常使用以下参数：1）用IL-4进行原代培养期间的细胞扩增因子（96小时内超过60倍）和用IL-21进行二次培养（在96小时内超过100倍）。 2）初级和二级培养后的FACS谱：有效的类别转换为IgG1和IgE（但不超过50％的IgE + 细胞）和GL7和Fas的均一表达，以及对CD138的最小分化原代培养后 + 细胞。大多数FBS批次可以支持40LB细胞的扩增和存活。

食谱

注意：准备以下溶液时，将所有组件混合在无菌罩中。

3T3媒体
D-MEM补充10％热灭活的胎牛血清（FBS）
100 U / ml青霉素
100μg/ ml链霉素
储存在4°C，保质期：自生产之日起2个月
注意：通过在56°C温育30分钟，可以使FBS热灭活。
B细胞培养基（BCM）
RPMI-1640补充10％热灭活FBS
10mM HEPES-NaOH pH 7.5
5.5×10 -5 M 2-ME
100 U / ml青霉素
100μg/ ml链霉素
储存在4°C，保质期：自生产之日起2个月
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
1. 原料（20x）：溶解160g NaCl，4g KCl，23g Na 2 HPO 4 和4g KH 2 PO 在MilliQ水中4
2. 用MilliQ水填充高达1升
3. 用MilliQ水和高压灭菌器稀释1:20
储存在4°C，保质期：自生产之日起1年
MACS缓冲区
1. 制备500ml补充有2mM EDTA和高压灭菌器的PBS
2. 加入12.5ml0.22μm过滤的20％BSA的PBS溶液
储存在4°C，保质期：自生产之日起6个月
用于B细胞分离的抗体混合物
100μl含有3μg/ ml生物素化抗CD43的MACS缓冲液 2.5μg/ ml生物素化抗Ter119
1.5μg/ ml生物素化抗CD4
1.5μg/ ml生物素化抗CD8
1.5μg/ ml生物素化抗CD49b
在使用之前制作鸡尾酒
注意：除了B细胞，例如巨噬细胞，粒细胞，树突细胞和T细胞外，抗CD43抗体可用于消除各种免疫细胞。抗CD49b抗体识别NK和NKT细胞。两种抗体的添加改善了B细胞的纯度。
用于饲养细胞耗竭的抗体混合物（来自一个10cm培养皿的细胞）
含有2.89μg/ ml生物素化抗H-2K d的260μlMACS缓冲液
要同时耗尽浆细胞，将1.15μg/ ml的生物素化抗CD138加入鸡尾酒中
在使用之前制作鸡尾酒

致谢

本协议从我们文章的原始版本（Nojima et al。，2011）进行了修改。作者要感谢Takuya Nojima博士和Tatsuya Moutai博士对iGB文化系统的发展所做出的贡献。这项工作得到了科学研究助理（B）对D.K.的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

Fukao，S.，Haniuda，K.，Nojima，T.，Takai，T。和Kitamura，D。（2014）。 gp49B介导的记忆和边缘区B细胞抗体产生的负调节。 J Immunol 193（2）：635-644。
Haniuda，K.，Fukao，S.，Kodama，T.，Hasegawa，H。和Kitamura，D。（2016）。自主膜IgE信号传导可阻止IgE记忆的形成。 Nat Immunol 17（9）：1109-1117。
Moutai，T.，Yamana，H.，Nojima，T。和Kitamura，D。（2014）。使用体外选择的抗原特异性B细胞的新型有效癌症免疫治疗小鼠模型。 PLoS One 9（3）：e92732。
Nojima，T.，Haniuda，K.，Moutai，T.，Matsudaira，M.，Mizokawa，S.，Shiratori，I.，Azuma，T。和Kitamura，D。（2011）。体外衍生的生发中心B细胞差异产生记忆B或血浆 Nat Commun 。