材料和试剂

生物危害废物容器（Tarsons，目录号：583254）
细胞培养皿，35×10mm（Eppendorf，目录号：0030700112）
Cryo-vials（Tarsons，目录号：523182）
Cryo-tags（Tarsons，Cryo-babies，目录号：526070）
FACS管（Corning，目录号：352063）
分级离心管，15 ml（Tarsons，目录号：546021）
分级离心管，20 ml（Tarsons，目录号：546041）
分级20μl微提示（Tarsons，目录号：521000）＆nbsp;
分级200μl，1,000μl微尖（Thermo Fisher Scientific，目录号：90030100,90030210-P）
组织培养处理，平底96孔板（Eppendorf，目录号：6030730119）
Whatman滤纸（Whatman，目录号：1001 125）
10 ml血清玻璃移液器（Himedia，目录号：CG316-1x10NO）
无菌培养皿（Tarsons，目录号：460051）
无菌过滤装置（0.22μm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：450-0020）
抗体（表1）

表1.抗体详情
bordercolor =“＃000000”style =“width：700px;” border =“1”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>的 S上。不。
标记
<强>抗体制造商
稀释
每50μlFACS缓冲液添加量
1。 CD29
抗人CD29 PE
BD Biosciences，目录编号：555443
1：100
0.5μl
2。 CD34
抗人类CD34 FITC
Thermo Fisher Scientific，目录号：CD3458101
1：100
0.5μl
3。 CD44
抗人CD44 FITC
BD Biosciences，目录号：555478
1：100
0.5μl
4。 CD49e
抗人CD49e PE
BD Biosciences，目录号：555617
1：100
0.5μl
5。 CD73
抗人CD73 PE
BD Biosciences，目录号：550257
1：100
0.5μl
6。 CD90
反人类CD90 FITC
BD Biosciences，目录号：555595
1：100
0.5μl
7。 CD105
抗人CD105 PE
BD Biosciences，目录号：560839
1：100
0.5μl
8。 HLA1
抗人类HLA1 FITC
BD Biosciences，目录号：555552
1：100
0.5μl
9。同型对照
抗小鼠IgG1 PE
BD，目录编号：556561
1：100
0.5μl
10。同型对照
抗小鼠IgG1 FITC
BD，目录编号：554109
1：100
0.5μl
10x胰蛋白酶（2.5％）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15090-046）
茜素红S（Sigma-Aldrich，目录号：199962）
抗坏血酸-2-磷酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：A8960）
β-甘油磷酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：G9891）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418-250ML）
地塞米松（西格玛奥德里奇，目录号：D2915）
纤连蛋白溶液（Sigma-Aldrich，Fibronectin human plasma，目录号：F0895）
甲醛溶液37-41％（w / v）（默克，目录号：61780805001730）＆nbsp;
汉克的平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich，目录号：55021C）
IBMX（Sigma-Aldrich，目录号：I-5879）
吲哚美辛（Sigma-Aldrich，目录号：I-7378）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：91077C）
异丙醇（默克，目录号：1.07022.2521）
油红O（Sigma-Aldrich，目录号：O-0625）
氯化钾（KCl）（默克，目录号：61779205001730）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（默克，目录号：60487305001730）
碘化丙锭（Sigma-Aldrich，目录号：P4170）
Safranin O（西格玛奥德里奇，目录号：S8884）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
氯化钠（NaCl）（默克，目录号：1.93206.0521）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）（默克，目录号：61787405001730）
含有L-谷氨酰胺培养基的DMEM-低葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D2902-1L）
含有L-谷氨酰胺培养基的DMEM-高葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D5648-1L）
胎牛血清（赛默飞世尔科技，目录号：10270）
100x青霉素（10,000单位/ ml） - 链霉素（10,000单位/ ml）抗生素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140-122）
StemPro软骨形成分化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：A10071-01）
去离子水（dH 2 O）（Merck，Elix Type 2纯水）＆nbsp;
台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T6146）
液氮（99.999％）*
氢氧化钠（NaOH）（默克，目录号：61843805001730）
盐酸35％（HCl）（默克，目录号：61762505001730）
DMEM培养基（见食谱）
1. DMEM-LG（低葡萄糖）/ DMEM-HG（高葡萄糖）基础培养基
2. MSC生长培养基
组织收集培养基（见食谱）
纤维连接蛋白溶液（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
1. 10x PBS
2. 1x PBS
3. PBS含1x抗生素
1x胰蛋白酶（0.25％）（见食谱）
0.4％台盼蓝（见食谱）
热灭活FBS（见食谱）
冷冻媒体（见食谱）
FACS缓冲液（见食谱）
碘化丙锭染色液（见食谱）
成骨诱导培养基（见食谱）
脂肪生成诱导培养基（见食谱）
4％甲醛溶液（见食谱）
茜素红染色液（见食谱）
油红O解决方案（见食谱）
1. 1％油红O原液
2. 油红O染色液
软骨分化培养基（见食谱）
0.1％番红O染色液（见食谱）

设备

冷冻冷却器（Tarsons，目录号：525000）
消毒尖尖镊子和手术刀
分析天平（Sartorius，Quintix Analytical Balance 60,120 g x 0.01,0.1 mg）
低温细胞储存容器（International Cryogenics，型号：D-2000C）
生物安全2级柜（赛默飞世尔科技，型号：1300系列A2）＆nbsp;
CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，Hera Cell 150i）
流式细胞仪（Becton Dickinson，FACS calibur和BD细胞任务软件）
血细胞计数器（亮线血细胞计）（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629）
带摄像头的倒置显微镜（Zeiss，Axio Vert.A1）
移液器控制器（Socorex，Profiller 446）
单通道移液器，0.5-20μl，20-200μl和100-1,000μl（Gilson，Pipetman classic）
冷冻离心机（赛默飞世尔科技，Sorvall传奇X1R）
水浴（Thermo Fisher Scientific，Labline水浴）
超低温冰箱（-80°C冰箱）（Thermo Fisher Scientific，Forma 88000系列）
4°C冰箱*
-20°C冰柜*
高压灭菌器*

*注意：这些物品可以从任何合格的公司订购。

软件

FlowJo软件（FlowJo，LLC）

程序

分离额外的眼肌来源的MSCs（EOM-MSCs）
1. 从患者收集切除的EOM组织（约3-8mm 3 ）并将其转移至具有3-4ml收集培养基的小瓶中（参见食谱）。在运输过程中使用冰袋将组织保持在低温。
注意：按照无菌培养技术，在生物安全2级柜内进行以下步骤。
1. 在处理组织样品之前，用浓度为20ng / cm 2的纤连蛋白包被隔离培养皿。向35mm细胞培养皿中加入500μl纤维连接溶液（400ng / ml;参见配方），并将培养皿在37℃下在CO 2 培养箱中孵育1小时。去除多余的纤维连接蛋白，用3 ml 1x PBS冲洗培养皿一次（参见食谱）。＆nbsp;
2. 使用无菌镊子，将组织转移到含有10毫升含1x抗生素的PBS的无菌培养皿中（见食谱）。在室温下孵育组织5分钟以消毒并除去多余的血液。
3. 小心地将组织转移到涂有纤连蛋白的无菌35 mm细胞培养皿中，并使用无菌镊子将其撕成小块，或者如果需要，用无菌手术刀将组织切成小块。＆nbsp;
4. 将500μl温热的新鲜MSC生长培养基（参见食谱）加入培养皿中，通过在CO 2 培养箱中培养培养皿2小时使组织块附着，保持5％CO 2 和37°C＆nbsp;
5. 2小时后，再加入2毫升温热的MSC生长培养基，不要打扰组织碎片，将培养皿放回培养箱中（图1）。
  注意：在这段时间内轻轻地握住盘子，因为过度摇晃可以轻易地移除组织。
  
  图1.处理EOM组织的程序
6. 48小时后，小心地吸出培养基并用1.5-2ml新鲜的MSC生长培养基补充（见食谱），不要打扰/移走组织。
  注意：此后72小时内必须更换MSC生长培养基。＆nbsp;
7. 7-10天后，使用倒置显微镜检查外植体周围的附着细胞（图2）。此时确保培养物没有任何污染。＆nbsp;
8. 一旦在组织块周围观察到足够数量的附着细胞（200-300个细胞），使用细尖镊子轻轻移除组织外植体，而不用擦洗培养皿表面上的组织（图2）。
  注意：
  1. 由于大多数MSCs附着在外植体下方，因此在移除组织时必须小心不要打扰细胞。
  2. 丢弃生物危害废物容器中的纸巾。所有液体废物应在用次氯酸钠处理后适当处理。
  图2.分离的EOM-MSC的显微图像。 A.相位对比图像显示在分离后一周内来自组织外植体的MSC的出现。白色箭头表示已从组织迁移出的细胞。 B.第0代时EOM-MSC的相差图像。比例尺：200μm。
维护文化
一旦细胞集落达到50％-80％汇合，则按如下方式对其进行亚培养。
1. 吸出培养基（用过的培养基）并在无菌的15ml离心管中收集。用PBS清洗细胞两次。＆nbsp;
2. 将500μl1x胰蛋白酶（参见食谱）加入培养皿中，37°C孵育5-7分钟。
  注意：＆nbsp;
  1. 在使用前从4°C取出后，将胰蛋白酶在室温下保持5-10分钟。
  2. 在显微镜下间歇地监测细胞分离。可能需要在盘子侧面轻柔地敲击圆形细胞。不要将细胞留在胰蛋白酶中超过10分钟。
3. 加入1-2毫升用过的培养基中和胰蛋白酶，将细胞转移到标记的15毫升离心管中。＆nbsp;
4. 在4℃下以300 x g 离心5分钟以获得细胞沉淀。弃去上清液，将沉淀重新悬浮于1 ml新鲜MSC生长培养基中。＆nbsp;
5. 等分小体积（~50μl）细胞并加入等体积的0.4％台盼蓝。正确混合并使用血细胞计数器计数活细胞。＆nbsp;
6. 在组织培养皿中以1-2×10 3个细胞/ cm 2培养物种细胞，并加入2ml新鲜MSC生长培养基。将培养皿在37℃下在5％CO 2 培养箱中孵育。＆nbsp;
7. 每72小时更换MSC生长培养基直至细胞达到70％-80％汇合。通过重复步骤B1-B6，细胞可传代达10-12次。＆nbsp;
EOM-MSCs的冷冻和解冻
1. 在步骤B5之后，将1×10 6个细胞重新悬浮在0.5ml预冷的无菌FBS中（参见食谱）。＆nbsp;
2. 将细胞悬浮液转移到标记的冷冻小瓶中，并加入等体积的预冷冻结培养基（参见食谱）。轻轻混合并将小瓶立即转移至低温冷却器。
3. 将冷冻冷却器保持在-80°C冰箱中24小时，然后将小瓶转移到装有液氮的低温细胞储存容器中，以便长期储存。
4. 为了使细胞复苏，将冷冻小瓶立即置于37℃的水浴中45-60秒进行解冻。
5. 向小瓶中加入0.5ml新鲜的温热MSC生长培养基，并将细胞悬浮液转移到无菌的15ml离心管中。逐滴加入另外4ml MSC生长培养基。
6. 将细胞在300℃下离心5分钟，在4℃下离心5分钟。将细胞沉淀重新悬浮于1ml新鲜MSC生长培养基中以除去任何剩余的DMSO。＆nbsp;
7. 如步骤B5中所述计数活细胞，并在具有2ml新鲜MSC生长培养基的35mm细胞培养皿中种子2-3×10 5个细胞。＆nbsp;
8. 12小时后更换生长培养基，然后根据步骤B7维持细胞。＆nbsp;
细胞表面标志物染色和流式细胞术
1. 如程序B中所述，胰蛋白酶消化并计数EOM-MSC。
  注意：在整个过程中将细胞保持在冰上以保持活力并减少表面标记物的内化。
2. 对于待分析的每种标志物，每个FACS管分配1×10 5个细胞用于用荧光团标记的抗体染色。对于使用的每种类型的抗体，保持另外的FACS管用非特异性同种型对照抗体作为对照染色。
3. 离心细胞，用3 ml PBS洗涤沉淀两次。
  注意：所有离心步骤均在300 x g 4°C下进行5分钟。
4. 将细胞重悬于50μlFACS缓冲液中（参见配方）。加入2μl稀释的抗体（参见表1中的抗体细节），然后在低RPM下短暂温和涡旋。在黑暗中将管在4°C孵育30分钟。＆nbsp;
5. 用1ml FACS缓冲液洗涤细胞，并重悬于300μl碘化丙啶染色缓冲液中（参见配方）。使用适当的通道增益/放大器设置在流式细胞仪中分析样品（图3）。
  
  图3. EOM-MSC的细胞表面标志物表达。 A.图显示流式细胞仪分析的门控;在FL3对FSC图中基于碘化丙啶（PI）阴性（FL3低）群体门控活细胞（G1），然后在FSC对比SSC图中门控（G2）以除去细胞碎片。进一步分析门（G2）中的细胞的荧光强度。 B.用针对CD29，CD34，CD44，CD49E，CD73，CD90，CD105和HLA I类的荧光缀合的抗体染色EOM-MSC，并通过流式细胞术分析表达。红色的直方图表示同种型对照，蓝色表示染色的样品。 Y轴表示事件/计数的数量，X轴表示所述细胞表面标志物的荧光强度。
成骨和成脂分化＆nbsp;
1. 如程序B中所述，胰蛋白酶消化并计数EOM-MSC。
2. 种子EOM-MSCs密度为5,000个细胞/ cm 2 用于成骨，20,000个细胞/ cm 2 用于在具有足够MSC生长培养基的96孔板中诱导脂肪形成（见食谱）。
3. 24小时后，分别在成骨和脂肪形成条件下添加成骨或脂肪生成诱导培养基（见食谱）。＆nbsp;
4. 每3-4天更换一次感应培养基，让细胞分化14-21天。＆nbsp;
用于评估成骨过程中钙沉积的茜素红染色
1. 吸出培养基并用PBS洗涤细胞两次。
2. 将细胞在4％甲醛溶液中（参见食谱）在室温下固定1小时。＆nbsp;
3. 用dH 2 O洗涤细胞两次。
4. 用新鲜制备的茜素红染色溶液（见食谱）在室温下染色10分钟。＆nbsp;
5. 用dH 2 O洗涤细胞5次，然后用PBS洗涤15分钟以除去过量的染色剂。在细胞中加入PBS以防止它们干燥。＆nbsp;
6. 继续在倒置显微镜下用相机对细胞成像（图4A）。＆nbsp;
用于评估脂肪生成期间脂质积累的油红O染色
注意：染色前至少1小时准备油红O染色液（见食谱）。
1. 吸出培养基并用PBS洗涤细胞两次。
2. 将细胞在4％甲醛溶液中（参见食谱）在室温下固定1小时。＆nbsp;
3. 取出定影液，用60％异丙醇在dH 2 O中冲洗。＆nbsp;
4. 用油红O染色溶液染色细胞10分钟。
5. 用dH 2 O洗涤细胞五次。向细胞中加入PBS以防止它们干燥。
6. 继续用倒置显微镜在相机下成像细胞（图4B）。＆nbsp;
软骨细胞分化＆nbsp;
1. 如程序B中所述，胰蛋白酶消化并计数EOM-MSC。
2. 将沉淀重新悬浮在合适的体积中以产生1.6×10 5个细胞/ ml的细胞悬浮液。将5μl这种细胞悬浮液滴加到96孔板中每个孔的中心，通过将板在5％CO 2 培养箱中37°温育2小时使细胞附着。 C.
3. 2小时后，向孔中加入足够的（100μl）软骨形成分化培养基（参见食谱），不会干扰细胞微团，并将培养板返回培养箱。
4. 每2天更换软骨形成培养基，使细胞分化为≥1％。 14天。
Safranin O染色检测软骨，粘蛋白和肥大细胞颗粒
1. 吸出培养基并用PBS洗涤细胞两次。
2. 用4％甲醛溶液（见食谱）将细胞在室温下固定1小时。＆nbsp;
3. 用dH 2 O洗涤细胞两次。
4. 用0.1％番红O溶液（见配方）在室温下染色5分钟。
5. 用dH 2 O洗涤细胞。在细胞中加入PBS以防止它们干燥。＆nbsp;
6. 继续使用倒置显微镜在相机下对细胞进行成像（图4C）。
  
  图4. EOM-MSCs分化为成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞。 EOM-MSCs接种于各自的细胞密度和诱导培养基中，用于分化为成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞谱系细胞。分化的细胞用（A）茜素红，（B）油红o（C）番红素染色，分别用于确定成骨，脂肪形成和软骨形成分化。比例尺：100μm。

数据分析

使用FlowJo软件分析用于在EOM-MSC上表达各种表面标志物的流式细胞术数据。在FL3对FSC图中基于碘化丙啶阴性（FL3低）群体对活细胞进行门控，然后在FSC对比SSC图中进行门控以除去细胞碎片。使用适当的同种型匹配的对照抗体，绘制FL1中的信号（对于FITC-缀合的抗体）和FL2（对于PE-缀合的抗体）的直方图以定义阴性（未染色）和阳性（染色）群体。该协议仅显示一个EOM-MSC样品的代表性数据，不包括任何统计分析。

食谱

DMEM媒体
1. DMEM-LG（低葡萄糖）/ DMEM-HG（高葡萄糖）基础培养基
  10克DMEM-LG或DMEM-HG介质粉末
  3.7克碳酸氢钠
  10毫升100x青霉素 - 链霉素抗生素溶液
  用高压灭菌的去离子H 2 O将体积补足至1L 将pH调节至~7.0，因为过滤后pH趋于增加
  使用无菌过滤装置（0.22μm）过滤灭菌
  可在4°C下储存长达2个月
2. MSC生长介质
  DMEM-LG基础培养基中10％FBS
  使用无菌过滤装置（0.22μm）过滤灭菌
  储存在4°C并在两周内使用
组织收集介质
2x青霉素 - 链霉素抗生素在DMEM-LG基础培养基或HBSS溶液中
纤连蛋白溶液（400 ng / ml）
通过在100 ml dH 2 O中稀释40μl的1 mg / ml储备溶液来制备纤连蛋白的工作储备。
使用无菌过滤装置（0.22μm）通过过滤灭菌并在4℃下储存
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
1. 10x PBS
  80克NaCl
  2克KCl
  14.4g Na 2 HPO 4
  2.4 g KH 2 PO 4
  用高压灭菌的dH 2 O将体积补足至1L 使用无菌过滤装置（0.22μm）过滤灭菌
  在室温下储存
2. 1x PBS
  在H 2 O中稀释10倍PBS（10毫升，1毫升）10次将pH调节至7.4并在121℃下高压灭菌40分钟
  C。 PBS含1x抗生素
  在10ml 1x PBS中的100μl100x青霉素 - 链霉素抗生素
1x胰蛋白酶（0.25％）
在无菌冷1x PBS中稀释10倍胰蛋白酶10次（1 ml 10x胰蛋白酶在9 ml PBS中）并准备5 ml等分试样用于
将等分试样储存在-20°C下长期储存。在室温下解冻并在使用后储存在4°C下长达1周
0.4％台盼蓝
将50毫克台盼蓝（染料组合物40％）溶于5毫升1×PBS中使用无菌过滤装置（0.22μm）过滤灭菌
在4°C下保存为等分试样＆nbsp;
热灭活FBS
通过在水浴中于56℃温育1小时来加热灭活FBS，并在-20℃下以50ml等分试样储存
冻结媒体
在热灭活的FBS中的20％DMSO（在4ml FBS中的1ml DMSO）
FACS缓冲区
1x PBS中2％热灭活的FBS（在9.8 ml PBS中200μlFBS）
碘化丙啶染色液
在FACS缓冲液中加入2μg/ ml碘化丙啶
成骨诱导培养基
DMEM-高葡萄糖基础培养基
1x青霉素 - 链霉素抗生素
10％FBS
10mMβ-甘油磷酸盐
0.1μM地塞米松
0.05 mM抗坏血酸-2-磷酸盐
注意：成骨诱导培养基可在4°C下储存长达4周。
脂肪生成诱导培养基
DMEM-高葡萄糖基础培养基
1x青霉素 - 链霉素抗生素
10％FBS
1μM地塞米松
0.2mM吲哚美辛（加入2滴5M NaOH溶解）
0.5 mM IBMX
0.01 M胰岛素（加入2滴5 M HCl溶解）
注意：脂肪生成诱导培养基可在4°C下储存长达4周。
4％甲醛溶液
在1x PBS中稀释37％-41％甲醛溶液10次
1毫升37％-41％甲醛溶液
9毫升1x PBS
茜素红染色液
0.19克茜素红S
10毫升dH 2 O
将pH调节至4.2
油红O解决方案
1. 1％油红O原料溶液
  1克油红O
  100毫升异丙醇
  在56°C的水浴中温热30-60分钟。并非所有油红O都会溶解
  可在室温下储存长达6个月
2. 油红O染色液
  3份1％油红O原液
  2份dH 2 O
  混合并静置1小时
  用Whatman滤纸过滤溶液
软骨分化培养基
10 ml 10x Stem Pro软骨细胞生成补充剂
90 ml Stem Pro骨细胞/软骨细胞分化基础培养基
1x青霉素 - 链霉素抗生素
注意：软骨形成分化培养基可在4°C下储存长达4周。
0.1％番红O染色液
0.1克Safranin O
100毫升dH 2 O
搅拌帮助解散

致谢

这项工作得到了印度医学研究委员会（ICMR）政府的支持。印度协议改编自Mawrie 等人（2016）。作者感谢Trishna Anand和Vishnu在成像方面提供的帮助。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

伦理

该研究得到了IIT Guwahati伦理委员会的批准，并在患者书面知情同意后收集样本。

参考

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