材料和试剂

移液器吸头
显微镜载玻片
盖玻片（厚度0.17至0.25毫米）
24孔细胞培养板
1.5毫升管
FITC标记的体外转录单指导RNA，sgRNA（合成也可以使用）
pSPCas9（Addgene，px165）
Opti-MEM减少血清培养基（Thermo Fisher，Gibco，目录号：31985062）
Dulbecco的改良Eagle培养基，DMEM（Thermo Fisher，Gibco，目录号：11960077）
胎牛血清（Thermo Fisher，Gibco，目录号：16000044）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher，Gibco，目录号：15140148）
磷酸盐缓冲盐水或PBS（Fisher Scientific，Corning，目录号：21040CV）
由聚（γ -4 - （（2-（哌啶-1-基）乙基）氨甲基）苄基-L-谷氨酸（PPABLG）配制的载体，如螺旋纳米颗粒（HNP）（见食谱）或Lipofectamine 3000（Thermo Fisher，目录号：300001）等脂质纳米粒子
肝素（Stemcell Technologies，目录号：07980）
RadioImmunoPrecipitation Assay（RIPA）裂解缓冲液（Thermo Fisher，Pierce，目录号：89900）
BCA蛋白质测定（Thermo Fisher，Pierce，目录号：23225）
多聚甲醛（Thermo Fisher，ACROS，目录号：28906）
DAPI（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：D1306）
Lysotracker Red（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：L12492）
安装介质（Sigma-Aldrich，Fluoromount，目录号：F4680）
胰蛋白酶-EDTA 0.25％（Thermo Fisher，Gibco，目录号：25200056）
Genistein（Sigma-Aldrich，Sigma，目录号：G6649）
盐酸氯丙嗪（Sigma-Aldrich，Sigma，目录号：C8138）＆nbsp;
Wortmannin（Sigma-Aldrich，Sigma，目录号：W1628）
甲基-β-环糊精或mβCD（Sigma-Aldrich，Sigma，目录号：C4555）
FITC（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：F2181）
Tris缓冲液（Sigma-Aldrich，Sigma，目录号：21685）
YOYO-1 Iodide（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：Y3601）
HiScribe T7高产RNA合成试剂盒（New England Biolabs，HiScribe，目录号：E2040S）
Fluorescein-12-UTP（Sigma-Aldrich，Roche，目录号：11427857910）
γ - （4-乙烯基苄基）-L-谷氨酸N-羧酸酐（VB-L-Glu-NCA）
无水二甲基甲酰胺（DMF）
六甲基二硅
硝基苯
己烷
醚
氯仿
O 3 气体
甲醇
1-（2-氨基乙基）哌啶
硼烷 - 吡啶络合物
细胞培养基（见食谱）
4％多聚甲醛（见食谱）

设备

移液器
37°C，5％CO 2 培养箱＆nbsp;
流式细胞仪（BD Biosciences，BD FACSCalibur，目录号：342975）
微量
共聚焦激光扫描显微镜，40x物镜（Zeiss，型号：LSM 700）
4°C冰箱
涡流混合器
手套箱
层流罩
Fluostar Optima（BMG，Fluostar Optima，目录号：0413B0001J）或任何激发波长为485 nm，发射波长为530 nm的荧光读板器

软件

计算机运行Flowjo（Flowjo LLC， https://www.flowjo.com/ ）或任何流式细胞仪数据分析软件
计算机运行BMG Optima Windows（BMG， https://www.bmglabtech.com/discontinued-microplate-读者/ ）或任何其他荧光板阅读器软件

程序

用YOYO-1标记的质粒测定颗粒的细胞摄取
1. 通过在分子生物学级水中以1mg / ml的pSPCas9（Addgene，px165）和添加20μMYOYO-1制备YOYO-1标记的质粒，使得每50bp DNA有1个染料分子。例如，对于1ml总体积，加入1mg质粒和25.4μgYOYO-1。
2. 在摄取研究前24小时，通过在24孔板中每孔接种5×10 4个细胞/孔（例如HEK293T）来制备细胞。＆nbsp;
3. 将YOYO-1标记的质粒加载到递送载体中（例如，通过向1μg质粒中加入30μgPPABLG将30：1PPABLG与质粒结合，并使其在冰上静置15分钟）。
4. 将步骤A3中的颗粒添加到每个孔中，总体积为500μl的1μgsgRNA/ ml OptiMEM。
5. 从24孔板中取出培养基，替换为500μlOptiMEM和含有荧光标记的核酸的递送载体。孵育4小时。
6. 用含有肝素（20U / ml）的500μl/孔冷PBS洗涤细胞三次，以除去外部相关的荧光标记的核酸。
7. 应用500μlRIPA裂解缓冲液并收集裂解液。
8. 使用荧光分光光度计，激发波长485nm，发射波长530nm，得到每种裂解物的特定荧光强度。使用标记质粒的标准曲线将裂解物的荧光强度与ng质粒相关联。
9. 进行BCA测定以确定裂解物的总蛋白质浓度。
10. 然后将细胞摄取水平表示为每mg蛋白质的ng YOYO-1标记的质粒。
使用FITC标记的sgRNA确定细胞对细胞的摄取
1. 通过使用HiScribe T7高产量RNA合成试剂盒制备FITC标记的体外转录的sgRNA，并以特定比例对未标记的UTP进行荧光素-12-UTP的消化。为了计算荧光素-12-UTP与UTP的比率，计算sgRNA序列中的尿嘧啶数，并且基于每个sgRNA链的2个荧光素，将荧光素-12-UTP以2比率（总数）加入到UTP中。 UTP）-2。
  示例：对于包含三个UTP的RNA链序列GGCTGATGAGGCCGCACATG，我们希望以2：1的比例将荧光素-12-UTP添加到UTP中。因此，在反应混合物中使用7.5 mM终浓度的UTP时，我们希望5 mM是荧光素-12-UTP和2.5 mM UTP。
2. 在摄取研究前24小时，通过在24孔板中每孔接种2.5×10 4个细胞/ cm 2 细胞/例如HEK293T，制备细胞。＆nbsp;
3. 将FITC标记的sgRNA加载到递送载体中（例如，将30：1PPABLG与sgRNA组合并让其在冰上静置15分钟）。
4. 将步骤B3中的颗粒加入到孔中，总体积为500μl/孔，1μgsgRNAs/ ml OptiMEM。
5. 从24孔板中取出培养基，用500μlOptiMEM和含有荧光标记的核酸的递送载体替换。孵育4小时。
6. 用含有肝素（20U / ml）的冷PBS洗涤细胞三次。
7. 将每个孔胰蛋白酶消化成细胞悬浮液（每孔约200μlDMEM），然后使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行流式细胞术分析。使用FITC阳性和强度量化摄取。
用于确定遗传货物的细胞内分布
1. 通过在分子生物学级水中以1mg / ml的pSPCas9（Addgene，px165）和添加20μMYOYO-1制备YOYO-1标记的质粒，使得每50bp DNA有1个染料分子。
2. 将种子细胞置于24孔板中的盖玻片上，密度为5×10 4个细胞/孔，并培养24小时。
3. 按照步骤A3-A5继续进行转染。
4. 用含有肝素（20U / ml）的冷PBS洗涤细胞3次。
5. 在PBS中加入500μl/孔的4％多聚甲醛（参见配方）并在室温下孵育15分钟以固定。
6. 根据Thermo Fisher提供的标准方案，用DAPI和具有Lysotracker Red的内体/溶酶体染色细胞核。
7. 使用载玻片和Fluoromount水性安装介质安装载玻片。
8. 通过共聚焦激光扫描显微镜观察40x物镜。在溶菌素标记后立即观察为漂白和标记丢失在数小时内发生。
9. 通过荧光图像，注意Lysotracker和YOYO-1标记质粒的共定位，以确定质粒是否在内体或胞质溶胶中。
  注意：细胞体中的粘性YOYO-1荧光意味着内体逃逸，而与Lysotracker的尖锐共定位意味着内涵体陷阱。
用于确定能量依赖性对细胞摄取的贡献
注意：重复步骤A但在4°C。
1. 通过在分子生物学级水中以1mg / ml的pSPCas9（Addgene，px165）和添加20μMYOYO-1制备YOYO-1标记的质粒，使得每50bp DNA有1个染料分子。
2. 在摄取研究前24小时，通过在24孔板中每孔接种5×10 4个细胞/孔（例如HEK293T）来制备细胞。＆nbsp;
3. 在转染前将细胞在4℃预孵育30分钟。
4. 将YOYO-1标记的质粒加载到递送载体中（例如，将30：1PPABLG与质粒组合，并使其在冰上静置15分钟）。
5. 将步骤D4中的颗粒添加到每个孔中，总体积为500μl1μggsgRNA/ ml OptiMEM。
6. 从24孔板中取出培养基，用500μl预冷的OptiMEM和含有荧光标记的核酸的递送载体替换。在4°C孵育2小时。
7. 用含有肝素（20U / ml）的冷PBS洗涤细胞三次。
8. 应用500μlRIPA裂解缓冲液并收集裂解液。
9. 使用荧光分光光度计，激发波长485nm，发射波长530nm，得到每种裂解物的特定荧光强度。
10. 进行BCA测定以确定裂解物的总蛋白质浓度。
11. 然后将细胞摄取水平表示为每mg蛋白质的ng YOYO-1标记的质粒，并且可以与作为对照的方法A进行比较。使用标记质粒的标准曲线将裂解物的荧光强度与ng质粒相关联。
用于测定细胞摄取对细胞膜穴样内陷介导的内吞作用的贡献（a），网格蛋白非依赖性内吞作用（b），网格蛋白介导的内吞作用（c）和巨胞饮作用（d）
1. 通过在分子生物学级水中以1mg / ml的pSPCas9（Addgene，px165）和添加20μMYOYO-1制备YOYO-1标记的质粒，使得每50bp DNA有1个染料分子。
2. 在摄取研究前24小时，通过在24孔板中每孔接种5×10 4个细胞/孔（例如HEK293T）来制备细胞。＆nbsp;
3. 将具有特异摄取机制抑制剂的细胞与完全培养基在37°C下混合预孵育30分钟。
  注意：每种感兴趣的抑制剂应单独使用，以确定每种途径的具体意义。
  1. 100μg/ ml染料木黄酮
  2. 5mMmβCD＆nbsp;
  3. 10μg/ ml氯丙嗪
  4. 10μg/ ml渥曼青霉素
4. 将YOYO-1标记的质粒加载到递送载体中（例如，将30：1PPABLG与质粒组合，并使其在冰上静置15分钟）。
5. 将来自步骤E4的颗粒添加至每个孔，总体积为500μl1μgsgRNA/ ml OptiMEM。
6. 从24孔板中取出培养基，替换为500μlOptiMEM和含有荧光标记的核酸的递送载体。孵育2小时。
7. 用含有肝素（20U / ml）的冷PBS洗涤细胞三次。
8. 应用500μlRIPA裂解缓冲液并收集裂解液。
9. 使用荧光分光光度计，激发波长485nm，发射波长530nm，得到每种裂解物的特定荧光强度。
10. 进行BCA测定以确定裂解物的总蛋白质浓度。
11. 然后将细胞摄取水平表示为每mg蛋白质的ng YOYO-1标记的质粒。使用标记质粒的标准曲线将裂解物的荧光强度与ng质粒相关联。＆nbsp;
用于测定膜渗透性
1. 在摄取研究之前24小时通过在24孔板中每孔接种5×10 4个细胞/孔（例如HEK293T）来制备细胞。
2. 在使用前将FITC在Tris缓冲液中孵育1小时或在-20℃下储存，制备FITC-tris。加入50μlFITC（1mg / ml）用于1ml Tris缓冲液。
3. 通过在OptiMEM中添加浓度为30μg/ ml的颗粒（PPABLG）并以500μl/孔添加到细胞中，用转染剂预孵育细胞。＆nbsp;
4. 然后以1μg/孔添加FITC-tris。
5. 在37°C孵育2小时。
6. 用含有肝素（20U / ml）的冷PBS洗涤细胞三次。
7. 应用500μlRIPA裂解缓冲液并收集裂解液。
8. 使用荧光分光光度计，激发波长为488nm，发射波长为530nm，以获得每种裂解物的特定荧光强度。
9. 进行BCA测定以确定裂解物的总蛋白质浓度。
10. 然后将细胞摄取水平表示为每mg蛋白质的ng FITC。使用FITC-tris的标准曲线将裂解物的荧光强度与FITC摄取相关联。

数据分析

最初通过方法A测定颗粒的总细胞摄取，并表示为每mg蛋白质的ng YOYO-1标记的质粒。在该初始摄取研究之后，程序C-H提供每mg蛋白质的ng YOYO-1标记质粒的摄取结果;这可以除以程序A的结果，得到抑制后的摄取百分比，如图2所示。此外，这可以从100％减去近似抑制百分比。

图2.各种治疗的摄取比较使用初始内吞作用实验的摄取作为抑制剂摄取测量标准化的参考。

例如：标准曲线可以确定如下：

然后可以通过将数据拟合到标准曲线（如上所述）并从裂解物的荧光读数提供X来计算浓度（Y）。下面，我们提供了一个示例计算，其中 b 是通过将数据拟合到浓度与荧光的线性曲线得到的斜率， a 是Y轴截距。 />
X = b * Y + a
X = 61800Y + 1100
Y = 1 /（61800）*（X-1100）

图3.细胞膜通透性使用裂解液中FITC-Tris的量与膜通透性相关联。能够进入细胞的FITC-Tris越多，纳米颗粒（或任何细胞处理）在细胞膜中诱导的渗透性越大。这里UT指未经处理的组，而Free FITC-Tris是暴露于FITC-Tris的未处理组; HNP和P-HNP分别是螺旋纳米颗粒和聚乙二醇化螺旋纳米颗粒。

然后我们可以计算出吸收和抑制百分比，如图3所示，其中以下是来自程序A，C，D的荧光读数，如下面的第一列：

食谱

细胞培养基
500毫升Dulbecco's改良Eagle's培养基
5毫升青霉素 - 链霉素（10,000 U / ml）
50毫升胎牛血清
由PPABLG（运载工具）组成的HNP
注意：PPABLG只是一种聚合物，可用于配制带有遗传货物的螺旋纳米粒子，并且只是一个可用于观察细胞内细胞内运输和摄取的传递平台的一个例子。一些可以直接购买的简单车辆是二氧化硅纳米粒子或Lipofectamine等材料。
1. 在手套箱中，首先加入γ - （4-乙烯基苄基）-L-谷氨酸N-羧酸酐（VB-L-Glu-NCA）并溶于无水二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入DMF六甲基二硅氮烷（M / I = 200）和硝基苯的溶液
2. 聚合在室温下进行，直至NCA的转化率达到≥1％。 99％（通过傅里叶变换红外光谱监测）。通过在己烷：乙醚（1：1，v / v）中沉淀来纯化多肽前体，聚（γ - （4-乙烯基）苄基-L-谷氨酸）（PVBLG）
3. 然后将PVBLG溶解在氯仿中，通过在-78℃下将O 3 气体鼓入溶液中，将侧链乙烯基氧化成醛基。
4. 通过在甲醇中沉淀纯化得到的多肽，聚（γ - （4-醛）苄基-L-谷氨酸）（PABLG），并通过1 H NMR分析以确认侧链乙烯基的转化组
5. 然后将PABLG溶解在DMF中，依次加入1-（2-氨基乙基）哌啶和硼烷 - 吡啶络合物与PABLG的侧链醛基反应
6. 通过对去离子水透析纯化最终产物PPABLG，然后冻干得到白色粉末
4％多聚甲醛
25毫升多聚甲醛
75毫升PBS

致谢

该研究得到NIH（Grants编号HL109442，AI096305，GM110494和UH3 TR000505）的支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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