材料和试剂

GTA供体毒株（见注1）
受体菌株（见注1）
RCV肉汤（Beatty和Gest，1981）
YPS肉汤（Wall等人，1975）
YPS琼脂（每个受体 - 供体组合2个平板，每个供体一个平板，每个受体一个平板）
0.22μm过滤的GTA缓冲液（Solioz和Marrs，1977）
0.45μm低蛋白结合（PVDF）注射器过滤器（例如EMD Millipore，目录号：SLHV033RB）
平板摊铺机（包括95％乙醇+火焰）
1 ml注射器
用于有氧培养的试管（例如 Fisher品牌品牌，目录号：14-961-30）
用于厌氧/光合培养的培养管（例如Fisher品牌，目录号：14-959-37A /螺旋盖）
聚丙烯无菌培养管（例如Simport，目录号：T405-2A）
可选（如果转移光合作用标记物）：用于厌氧板生长的箱/包
RCV Medium（见配方）
YPS中等（见配方）
GTA缓冲区（参见配方）

设备

摇动培养箱
微量离心机
白炽灯箱或光孵化器
1ml移液管
1.5 ml微量离心管

程序

制备：
1. 在测定前3天，在RCV肉汤中接种GTA供体菌株，并在35℃（200-250rpm）有氧生长过夜。
2. 2天前，测量GTA供体菌株的过夜培养物的光密度（OD），并通过用RCV肉汤稀释将其标准化。稀释所有OD以匹配最低浓度是最简单的，因为只要所有培养物处于相同的最终密度，实际OD是不相关的。使用1％v/v的标准化供体的接种物接种没有抗生素的YPS肉汤，在35℃下在无振荡的情况下在两天内无氧生长和光合作用生长，偶尔通过颠倒培养管混合。这些培养管应该用YPS肉汤填充到边缘并密封，以产生无氧条件，并与光源等距离放置。白炽灯泡比荧光灯泡更好，但是从灯泡产生的热必须消散（例如通过在水箱中具有培养管）以维持培养温度。
3. 1天前，在RCV肉汤中接种受体菌株，并在35℃（200-250RPM）下有氧生长过夜。
测定：
1. 使供体菌株培养物通过0.45μm过滤器，在聚丙烯管中收集滤液。
2. 离心1ml接受者培养物，倾析上清液并重悬于等体积的GTA缓冲液中。
3. 将以下物质在聚丙烯管中混合：
  - 滤液对照（对于每种供体滤液）：0.5ml GTA缓冲液，0.1ml滤液 - 受体对照（对于每种受体菌株）：0.5ml GTA缓冲液，0.1ml受体细胞实验样品：0.4ml GTA缓冲液，0.1ml滤液，0.1ml受体细胞
4. 孵育管在35°C 1小时，没有摇晃。
5. 向每个管中加入0.9ml RCV肉汤。
6. 孵育管在35℃下3小时，在〜200 rpm摇动。
7. 将1.5毫升混合物从聚丙烯管转移到单独的1.5毫升微量离心管中
8. 板在板上150μl每种滤液+受体混合物以代表总量的10％。对于受体和滤液控制，这不是必需的
9. 离心所有试管，倾析上清液，并重悬在小（〜100微升）体积剩余的颗粒。将这些重悬浮在板上分别代表90％和100％的实验和对照测定。这些平板应当对标记的转移具有选择性，或在选择转移的标记的条件下生长。
10. 在30-35℃生长2-3天。
11. 计数菌落。确定实验平板上的集落相对于阳性对照（例如野生型菌株）上发现的集落数的比率。

笔记

一种常见的生物测定法使用监测puhA基因转移到puhA缺失突变体DW5（Wong等人，1996）的转移，其中选择转移的puhA 基因是光合生长的能力。该生物测定显示没有自发突变背景。另一种生物测定是利福平抗性的转移，其是一些R菌株的特性。（例如天然分离菌株B10（Weaver等人，1975））的利福平敏感性菌株。该生物测定具有低但可检测的自发突变背景的速率，其必须在数据分析中考虑
比较相同标记的转移是必要的，因为标记大小可影响生物测定结果（Hynes等人，2012），可能影响包装和重组率。
生物测定绝对数可以根据供体和受体细胞，培养基批次（例如，将一批酵母提取物用于YPS）的生长状态极大地变化，因此必须比较一个生物测定，并执行多个独立的重复。当对具有受损的生长或存活力的菌株/突变体进行生物测定时，通过在生物测定旁边进行活细胞计数，其可以帮助将转移速率标准化为活细胞数目（供体或受体，无论哪种受损）。 >

食谱

RCV中
7.5mM（NH 4）2 SO 4 4/
30mM DL-苹果酸盐，pH 6.8，用NaOH洗涤 54μMEDTA
0.8mM MgSO 4 0.51mM CaCl 2·h/v 43μMFeSO 4
3μM硫胺素-HCl
9.5μMMnSO 4
45μMH sub 3 BO ₃
0.2μMCu（NO 3）2 sub。 0.83μMZnSO 4
3μMNaMoO 4
4.5mM KH 2 PO 4>/
5.1mM K 2 HPO 4
pH至6.8
YPS中等
3.0 g/L酵母提取物
3.0 g/L蛋白胨 2mM MgSO 4 2mM CaCl 2 2 / 根据需要用NaOH或HCl将pH调节至7.0 为固体培养基添加1.5％琼脂
GTA缓冲区
10mM Tris-HCl（pH7.8）和NaOH 1.0mM MgCl 2·h/v 1.0mM CaCl 2/v/v 1.0 mM NaCl
500μg/ml BSA（组分V）
用0.22μm过滤器过滤灭菌

致谢

APH得到了来自纪念大学研究生学院和加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）的奖学金的支持。这项在ASL实验室的研究得到了NSERC，加拿大创新基金会和纽芬兰和拉布拉多研究与发展基金会的资助。发展公司。该协议基于最初报道的工作：Hynes等人（2012）。

参考文献

Beatty，J.T.和H.Gest（1981）。在光合细菌中产生琥珀酰辅酶A。 Arch Microbiol 129（5）：335-340。
Hynes，A.P.，R.G.Mercer，D.E.Watton，C.B.Buckley和A.S.Lang（2012）。 DNA包装偏差和基因转移剂基因在生产和释放期间的群体中的差异表达em> Rhodobacter capsulatus gene transfer agent，RcGTA。 Mol Microbiol 85（2）：314-325。
Solioz，M。和B.Marrs（1977）。红景天藻（Rhodopseudomonas capsulata）的基因转移剂。其核酸的纯化和表征。 Arch Biochem Biophys 181（1）：300-307。
Wall，J.D.，P.F.Weaver和H.Gest（1975）。在Rhodopseudomonas capsulata中的氮化酶 - 氢化酶活性的遗传转移。自然 258（5536）：630-631。
Weaver，P.F.，J.D.Wall和H.Gest（1975）。 Rhodopseudomonas capsulata的表征 Arch Microbiol 105（3）：207-216。
Wong，D.K.，W.J.Collins，A.Harmer，T.G.Lilburn和J.T.Batty（1996）。耻链球菌的定向诱变 puhA基因和orf 214：多效性对光合反应中心和光收获1复合物的影响。细菌 178（8）：2334-2342。