材料和试剂

移液器吸头
1.5毫升不含DNA酶/ RNase的微管
0.2ml不含DNA酶/ RNase的PCR带状管，带有单独的盖子
QIAamp DNA微型或迷你试剂盒（QIAGEN，目录号：56304或51306）
QuBit dsDNA BR检测试剂盒（赛默飞世尔科技，目录号：Q32853）
未甲基化的λ噬菌体DNA（Promega，目录号：D1521）
MspI 100 U /μl（New England Biolabs，目录号：R0106M）
Klenow片段5,000 U / ml（New England Biolabs，目录号：M0212L）
dNTP设定（4 x 100 mM）（赛默飞世尔科技，目录号：10297018）
PEG解决方案中的AMPure XP磁珠（Beckman Coulter，目录号：A63881）
用于Illumina®的NEBNext®MultiplexOligos（甲基化适配器，Index Primers Set 1）（New England Biolabs，目录号：E7535L）
T4 DNA连接酶2,000,000 U / ml（New England Biolabs，目录号：M0202M）
EpiTect Fast亚硫酸氢盐试剂盒（QIAGEN，目录号：59826）
SYBR Green，10,000x（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：S7563）
KAPA HiFi Uracil + 2x mastermix（罗氏，产品目录号：KK2802）
生物分析仪高灵敏度DNA分析（安捷伦，产品目录号：5067-4626）
DNase / RNase游离水
EB缓冲液（QIAGEN，目录号：19086）
NEB缓冲液2（New England Biolabs，目录号：B7002S）
乙醇100％

设备

P10，P20移液管
QuBit荧光测定装置（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q33226）
涡流
微型离心机
热循环仪
加热块
DynaMagTM-96侧磁铁（赛默飞世尔科技，目录号：12331D）
DynaMagTM-2磁铁（赛默飞世尔科技，目录号：12321D）
qPCR机器
qPCR plate2100＆nbsp;
生物分析仪（安捷伦，产品目录号：G2939BA）
Illumina测序仪
-20°C冰柜

程序

DNA提取和定量（估计时间：过夜裂解+ 2小时）
根据制造商的建议，使用QIAGEN QIAamp DNA micro或mini试剂盒从组织或培养细胞中提取DNA，具体取决于原始样品的大小。然后使用具有dsDNA BR测定试剂盒的Qubit荧光测定装置来定量DNA样品。为了确保亚硫酸氢盐转化的效率（方法F），可以加入0.5％（2.5ng）未甲基化的λ噬菌体DNA作为加入500ng样品DNA以提供内部对照。
酶消化（估计时间：过夜）
1. 对于每个样品，在来自带有单独盖的条管的0.2ml PCR管中，在不含DNA酶/ RNase的水中稀释500ng DNA，最终体积为26.8μl。
  注意：每个步骤使用0.2 ml带有单独瓶盖的PCR条管，以避免污染样品。
2. 通过每次反应混合3μl的10x NEB缓冲液2和0.2μl的100U /μlMspI酶来制备MspI酶的主混合物（表1）。
  
  表1. MspI消化混合物的制备
3. 向每个样品管中加入3.2μl主混合物。通过脉冲涡旋混合并短暂离心（即，旋转）反应。＆nbsp;
4. 将消化反应在37℃下在热循环仪中孵育过夜，盖子设定在42℃。
间隙填充和A尾（预计时间：1小时）
使用Klenow片段和dNTPs混合物（10 mM dATP，1 mM dCTP，1 mM dGTP）实现间隙填充和A尾加工。
1. 通过混合176μl不含DNA酶/ RNase的水，20μldATP（100mM），2μldCTP（100mM）和2μldGTP（100mM）制备dNTP混合物。等份的dNTP可以在-20℃下储存，用于将来的rRRBS实验。
2. 对于每个样品，通过组合1μl的dNTP混合物和1μl的Klenow片段酶制备主混合物（表2）。
  
  表2.间隙填充和尾矿混合物的制备
3. 在不停用MspI消化的情况下，在每个样品管中加入2μl主混合物。通过脉冲涡旋混合并短暂离心。＆nbsp;
4. 将管子放回热循环仪中，在30℃下循环20分钟，在37℃下循环20分钟。盖子不应该被加热。＆nbsp;
珠子清理（估计时间：1小时30分钟）
在间隙填充和A尾加工步骤后，PEG溶液中的AMPure XP磁珠用于清除先前试剂的反应。为了改善珠子的再悬浮，在55℃的加热块中加热EB缓冲剂。
注意：在55°C下预热EB缓冲液将有助于重新悬浮珠子，特别是如果它们过度干燥。
1. 向每个样品中加入64μl珠子（2倍比例的珠子[注1]）。通过缓慢上下移液至少10次混合。＆nbsp;
2. 在室温下孵育混合物30分钟。
3. 在DynaMagTM-96侧磁铁上加入0.2ml试管5分钟。在这个阶段，DNA与AMPure XP磁珠结合。＆nbsp;
4. 在不扰乱珠子的情况下，小心取出并丢弃上清液。
5. 通过加入100μl80％新制备的乙醇洗涤珠子。孵育5分钟并除去EtOH而不干扰珠子。
6. 重复步骤D5进行第二次洗涤。
7. 用P10移液管除去残留的EtOH。
8. 将珠子干燥约5分钟。不要过度干燥（即，如果过度干燥，珠环会出现裂缝），因为这会显着降低洗脱效率（注2）。＆nbsp;
9. 从磁架上取下试管，通过重复移液将珠子重新悬浮在26μl温热的EB缓冲液中，在室温下孵育2分钟（不在架子上）。＆nbsp;
10. 将管放回磁架中并孵育至少5分钟。确保所有珠子都绑在管壁上。
11. 小心取出上清液，不要取任何珠子，然后转移到新的PCR管中。
适配器结扎和珠子清理（预计时间：2小时）
下一阶段是连接适配器以用于将来的qPCR扩增和索引固定步骤。在这里，用于Illumina®的NEBNext®MultiplexOligos（甲基化适配器，Index Primers Set 1）试剂盒与T4 DNA连接酶结合使用。
1. 对于每个反应，制备8.5μl不含DNA酶/ RNase的水，5μlT4DNA连接酶10x缓冲液，10μlNEB甲基化衔接子和1.5μlT4DNA连接酶的主混合物。使用甲基化衔接子以避免在扩增步骤中与指数引物的任何不相容性是至关重要的。如果使用非甲基化的衔接子，亚硫酸氢盐处理会将非甲基化的胞嘧啶转化为胸苷，这将干扰未来反应中衔接子序列的识别（表3）。
  
  表3.衔接子连接混合物的制备
2. 在冰上，向每个26μlDNA样品中加入25μl主混合物。通过脉冲涡旋混合并短暂离心。
3. 在20°C下，在带有非加热盖的热循环仪中孵育20分钟。＆nbsp;
4. 从热循环仪中取出试管，每次加入3μlUSER酶（包含在NEBNext®MultiplexOligos试剂盒中）。在加入酶的同时将反应管保持在室温。通过脉冲涡旋混合，短暂离心并将管放回热循环仪中，在37°C下用非加热盖子放回热循环仪中15分钟。＆nbsp;
注意：执行第二次AMPure XP磁珠清理步骤。
1. 每个样品中加入55μl珠子。通过缓慢上下移液至少10次混合。＆nbsp;
2. 在室温下孵育5分钟。
3. 将管放在DynaMagTM-96侧磁铁上5分钟。在这个阶段，DNA被珠子捕获。＆nbsp;
4. 在不扰乱珠子的情况下，小心取出并丢弃上清液。
5. 通过加入100μl80％新制备的EtOH洗涤珠子。孵育5分钟并除去EtOH。
6. 重复步骤E9进行第二次洗涤。
7. 用P10移液管除去残留的EtOH。
8. 将珠子干燥约5分钟。不要过度干燥（注2）。
9. 从磁架上取下管子，将珠子重悬于25μl温热的EB缓冲液中，在室温下孵育2分钟（不在磁架上）。＆nbsp;
10. 将管放回磁架中并孵育至少5分钟，以确保所有珠子都粘在磁铁上。
11. 小心取出上清液，不要取任何珠子，放入新的PCR管中。
  注意：此时样品可以冷冻（-20°C），以便稍后继续（注3）。
亚硫酸氢盐转化（预计时间：3小时）
亚硫酸氢钠DNA处理允许区分甲基化和未甲基化的胞嘧啶。与先前描述的RRBS方法相比，我们的亚硫酸氢盐转化过程显着减少了与该步骤相关的时间。
由于亚硫酸氢钠处理的DNA对冷冻和解冻更敏感，因此最好进行亚硫酸氢盐转化和rRRBS文库的扩增而不停止以避免任何降解（注3）。（表4）

表4.亚硫酸氢钠转化反应的制备（来自QIAGEN EpiTect Fast亚硫酸氢盐试剂盒）
1. 每25μlDNA样品中加入85μl亚硫酸氢盐混合液。吸取上下至少10次。
2. 加入30μlDNA保护缓冲液。通过脉冲涡旋混合，短暂离心并将管置于热循环仪中。
3. 按照制造商的方案推荐，运行2个循环：95℃5分钟和60℃20分钟。
在孵育的最后几分钟期间，根据试剂盒手册的指示，通过将适当量的载体RNA与BL缓冲液混合来制备载体RNA（QIAGEN EpiTect Fast亚硫酸氢盐试剂盒）。对于亚硫酸氢盐反应程序的第二部分（即清除步骤），遵循制造商的方案。为了洗脱DNA，在柱子中间小心地加入15μlEB缓冲液，在室温下孵育5分钟，然后全速离心1分钟。用另外15μlEB缓冲液重复洗脱步骤。
rRRBS文库的扩增
该步骤是我们方法的主要改进之一，其使用定量PCR（qPCR）方法直接监测rRRBS文库的最终扩增以最小化过循环效应。在先前的方案中，使用不同的PCR循环数测试样品以确定在最终文库制备中使用的最小循环数。对于每个样品，通过在凝胶电泳上观察PCR反应确定适当数量的循环，然后对其余样品进行最终文库扩增步骤。因此，该方案更快，更准确地定义了文库扩增所需的适当PCR循环次数。＆nbsp;
1. 按照表5中提供的指示为每个样品制备大规模PCR混合反应.NEB通用引物和索引引物随甲基化衔接子试剂盒一起提供。 SYBR Green在10,000x原液中用水稀释至10倍。
  
  表5.用于文库扩增的qPCR混合物的制备
2. 通过在8条带PCR管（0.2ml）的各孔中分配25μl，将每个样品的200μl反应混合物分开。将PCR条插入Roche LightCycler96 qPCR仪器中，并在表6中所示的条件下运行。
  
  表6.qPCR扩增方案
3. 在达到平台期之前，在约12至15个循环后，在扩增的线性阶段结束时停止qPCR反应（图2）。
  注意：当同时放大各种文库时，它们可能不会同时达到平台期。具有足够扩增的样品可以在扩增循环结束时快速去除，并转移到另一台PCR机器进行最后7分钟的延伸步骤。＆nbsp;
4. 在72°C下进行7分钟的最终延伸步骤。
  
  图2. qPCR文库扩增图的示意图。 A.红线代表每个qPCR循环的总扩增产物积累。蓝色矩形表示应停止qPCR文库扩增的时间段;在指数阶段之后和高原阶段之前。公元前。 2个样品的文库扩增的实例（每个在8个孔中分离）在（B）循环14和（C）循环16停止。
rRRBS库的清理和大小选择（预计时间：1小时30分钟）
通过qPCR扩增rRRBS文库后，使用AMPure XP磁珠进行最后的清理步骤，以去除试剂和引物二聚体。＆nbsp;
1. 对于每个样品，将所有8个PCR反应汇集到1.5ml低结合DNase / RNase的试管中。＆nbsp;
2. 计算每个反应的精确体积，并将相同体积的珠子添加到PCR反应中以具有1x比率（注释1）（即，如果PCR后剩余200μl反应，则添加200μl珠子）。通过上下移液混合。 DNA /珠子1x比率将除去200bp以下的大多数片段和低于100bp的所有较小片段。
3. 在室温下孵育15分钟，每隔5分钟轻轻敲打管子，混合珠子和DNA。＆nbsp;
4. 将试管放入磁架中，静置10分钟。＆nbsp;
5. 小心取出并丢弃上清液，不要打扰珠子。
6. 通过将管保持在磁架上，通过添加1ml 80％新制备的EtOH来洗涤珠子。孵育5分钟并除去EtOH。
7. 重复步骤H6进行第二次洗涤。
8. 用P20移液管除去残留的EtOH。
9. 将珠子干燥约10分钟。不要过度干燥（注2）。＆nbsp;
10. 从磁架上取下试管，将珠子重新悬浮在40μl预热的EB缓冲液中。通过移液混合，在室温下孵育5分钟（不在架子上）。＆nbsp;
11. 将管子放回磁架中并孵育至少5分钟，以确保所有珠子都粘在磁铁上。
12. 小心取出上清液，不要取任何珠子，将溶液转移到新的1.5 ml管中。
质量控制（预计时间：1小时30分钟）
通过在2100生物分析仪上进行高灵敏度DNA分析来评估样品的质量和浓度。浓度根据输入DNA的原始量和不同步骤的效率而变化。峰应在200bp和300bp之间，浓度约为5ng /μl或更高。如果在Bioanalyzer上可以看到引物二聚体的峰，长度约为75 bp或150bp（参见图3），则进行第二次DNA /珠清理并在测序前重复进行Bioanalyzer质量评估。
注意：如果您观察到大约75 bp或150 bp的峰，则用1倍比例的珠子进行第二次DNA /珠子清理以去除所有引物二聚体，因为那些较小的片段会影响测序的质量。

图3. Bioanalyzer对最终文库的质量控制。 A.具有200bp和300bp之间的主峰的良好文库的实例，在较小尺寸下未观察到显着峰。 B.含有引物二聚体的文库的实例（在约75bp和/或150bp处的显着峰）。对于该样品，在对文库进行测序之前，必须进行第二次珠子清理（具有1倍比例的珠子）以去除引物二聚体。
排序
在Illumina装置上进行文库的配对末端测序（> 100bp阅读长度）。每个测序泳道的多重文库的数量取决于所用的测序技术和所研究的物种（即物种的CpG总数）（Doherty和Canrey，2014）。人们的目标应该是每个样本至少获得20-30万个读数用于下游生物信息学分析。

数据分析

各种生物信息学工具可广泛用于分析全基因组DNA甲基化测序数据，并且通常根据数据如何被解释和可视化（例如，单个CpG甲基化，耕作窗口方法）来定制。基本分析的细节在先前的论文中有详细描述（Magnus等，2014; McGraw等，2015;Piché等，2018）。简而言之，Trim Galore（Krueger，2015）用于序列修剪和质量控制，然后使用BSMAP（Xi和Li，2009）将读数与参考基因组比对，其特异于亚硫酸氢盐处理的测序DNA的比对。如果λDNA是掺入的，你可以通过绘制这个基因组并计算λ噬菌体参考基因组中胞嘧啶位置上未甲基化胞嘧啶（测序为胸腺嘧啶）的百分比来计算亚硫酸氢盐转化率（Lister et al。，2011））。使用BSMAP获得甲基化调用，并且使用R package methylKit获得跨两种条件的差异甲基化区域（Akalin等人，2012）。使用HOMER v4.10（Heinz等人，2010）注释差异甲基化序列。最终输出处理数据可用于各种其他下游分析，例如功能注释工具，以突出特定生物的富集[例如，DAVID（Dennis等人，2003），Metascape（Tripathi等人，2015）]，或转换为了查看各种基因组浏览器中的甲基化水平[例如，USCS基因组浏览器，IGV（Thorvaldsdottir等，2013）]，将特定格式（例如bedGraph）转换为特定格式。

笔记

1.珠子的比例对于确保良好的清理至关重要。为了确保添加适量的珠子，您可以在每个清理步骤中使用移液器测量样品的准确体积。
如果过度干燥，珠子环会出现裂缝。珠子将难以重悬，这将降低核酸洗脱效率。
停止点：建议在适配器连接步骤（程序E）后停止或在同一天完成所有协议。

致谢

研究由NS的NSERC发现补助金资助。 LML获得了CHU Sainte-Justine基金会和RéseauQuébécoisenReproduction奖学金。 SM由魁北克省魁北克省（FRQS）的Chercheur-boursier Junior 1提供支持。我们感谢Elizabeth Maurice-Elder的编辑。

竞争利益

作者宣称没有利益冲突。

参考

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