材料和试剂

移液器吸头（NIPPON Genetics Co.，Ltd。，目录号：FG-102，FG-301，FG-401）
Parafilm（LMS Co.，Ltd。，目录号：PF，PM-996）
1.5毫升微管（BM Equipment Co.，Ltd。，目录号：NT-175）
2.0毫升微管（WATSON Co.，Ltd。，目录号：132-620C）
50毫升离心管（Corning Incorporated。，目录号：352196）
AnaeroPouch（Mitsubishi Gas，目录号：2-3764-02）
AnaeroPack（三菱燃气，目录号：2-3765-01）
灭菌塑料板（Ø90mm）（As One Corporation。，目录号：GD90-15）
Cyanidioschyzon merolae 10D [以NIES-3377的形式从NIES collection，Tsukuba，Japan获得（ http://mcc.nies.go.jp/index_en.html ）]
玉米淀粉（Kawamitsu-Bussan，目录号：4901 486 02701 6）
结冷胶（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：073-03071）
Uracil（Sigma-Aldrich，目录号：U0750-5G）
5-氟乳清酸一水合物（5-FOA）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：003234）
乙醇（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：055-00457）
（NH 4 ） 2 SO 4 （FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：019-03435）
MgSO 4 ∙7H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：138-00415）
H 2 SO 4 （FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：192-04696）
H 3 BO 3 （FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：021-02195）
MnCl 2 ∙4H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：133-00725）
ZnCl 2 （FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：268-01022）
Na 2 MoO 4 ∙2H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：198-02471）
CoCl 2 ∙6H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：038-03681）
CuCl 2 ∙2H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：039-04135）
KH 2 PO 4 （FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：169-04245）
CaCl 2 ∙2H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：038-19735）
FeCl 3 ∙6H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：090-02802）
Na 2 EDTA（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：345-01865）
20％浆液玉米淀粉原液（见食谱）
MA2培养基（Kobayashi et al。，2010）（见食谱）
1. MA2解决方案I
2. A6次要盐
3. MA2解决方案II
4. MA2解决方案III
5. MA2解决方案IV
MA2固体结冷胶板（见食谱）

设备

移液器（Gilson，Inc.，目录号：F123600，F123601，F123602）
冷冻离心机（Koki Holdings Co.，Ltd.，型号：CF16RXII）
微量离心机（TOMY Seiko Co.，Ltd。，型号：MX150）
500毫升烧瓶（IWAI，目录号：4442FK500）
加热块（千代田科技有限公司，型号：MiniT-100）
生物培养箱（TOMY Seiko Co.，Ltd.，型号：CLE-303）
洁净工作台（Panasonic Healthcare Co.，Ltd.，型号：MCV-131BNF）
涡旋混合器（M＆amp; S Instruments Inc.，型号：SI-0286）
无菌过滤器（Ø0.22μm，Merck，目录号：SLGV033RS）

程序

准备MA2固体结冷胶板和20％浆液玉米淀粉原液（参见配方）。
将100μl玉米淀粉浆液储备液和900μl无菌dH 2 在2ml微管中混合。
在室温下以500×g离心微量离心1分钟并弃去上清液。
加入900μl无菌dH 2 O并剧烈混合。
在室温下再以500×g离心1分钟离心并弃去上清液。
加入900μl无菌dH 2 O并剧烈混合。
将微管在98°C孵育10分钟，但每2分钟翻转一次，继续充分混合。
在室温下冷却10分钟（=顶部淀粉溶液）。
注意：步骤8-11应在层流柜中进行。
加入1ml含有 C的MA2培养基。将merolae 细胞（在野生型的情况下，通过显微镜观察500个细胞）至顶部淀粉溶液并轻轻混合。
将混合物倒入MA2固体结冷胶板的表面上，并通过倾斜板将混合物铺展在整个板区域上以均匀地铺展顶部淀粉溶液。
将板打开15-20分钟以使顶部淀粉溶液固化。在该步骤之后，顶部淀粉的表面仍然是湿的，并且该板应该与顶部淀粉溶液一起向上培养整个时间。
将MA2固体结冷胶板在40°C下在连续白光（35-50μmolm -2 s -1 ）下孵育，补充5％CO 2 在AnaeroPack中使用AnaeroPouch。
2-4周后，转化细胞的菌落出现在MA2固体结冷胶板上。

食谱

20％浆料玉米淀粉原液（Fujiwara and Ohnuma，2018）
1. 将10g玉米淀粉和40ml dH 2 O加入50ml锥形管中
2. 使用涡旋混合器将管充分混合
3. 将管在1,200 x g 下在4℃下离心5分钟
4. 通过倾析丢弃上清液
5. 使用涡旋混合器将沉淀重悬于40ml的100％乙醇中
6. 将管在1,200 x g 下在4℃下离心5分钟
7. 通过倾析丢弃上清液
8. 用75％的乙醇填充50毫升
9. 将管存放在4°C，用封口膜包裹直至使用
MA2媒体
1. 在玻璃瓶中混合100毫升MA2溶液I，10毫升MA2溶液II，1毫升MA2溶液III和885毫升dH 2 O，并通过高压灭菌消毒
2. 在层流柜中向混合物中加入4ml MA2溶液IV
MA2解决方案我

A6次盐

MA2解决方案II

MA2解决方案III

MA2解决方案IV

注意：此MA2溶液IV应通过过滤灭菌，并在4°C黑暗中储存。
MA2固体结冷胶板（用于制作9-10个板）
1. 在500ml烧瓶中混合30ml MA2溶液I，3ml MA2溶液II，300μlMA2溶液III和70ml dH2S O.在另一个500ml烧瓶中混合200ml dH 2 和1.5g结冷胶。通过高压灭菌对这些烧瓶进行灭菌，随后的板制备应在层流柜中进行
2. 高压灭菌后，混合两种溶液并加入1.2ml MA2溶液IV。在5-FOA选择的情况下，分离 URA 缺陷型突变体（例如应用 URA 标记物回收系统，Takemura et al。，2018; Takemura et al。，2019），直接加入150毫克尿嘧啶（终浓度：0.5毫克/毫升）和240毫克5-FOA（终浓度：0.8毫克/毫升）粉末至烧瓶
3. 将混合溶液倒入灭菌的塑料板中
4. 在室温下干燥板15分钟
5. 在黑暗中于4°C储存

致谢

该方案改编自Takemura 等人（2018）。作者感谢Y. Ide提供技术支持。该研究得到MEXT / JSPS KAKENHI（授权号：17K07438至S.I.，17K07439至Y.K.）和日本科学技术厅（JST）的先进低碳技术研究与发展计划（ALCA）至K.T.的支持。

利益争夺

没有宣布竞争利益。

参考

Fujiwara，T。和Ohnuma，M。（2018）。转换程序及其在 Cyanidioschyzon merolae中的应用
Imamura，S.，Kanesaki，Y.，Ohnuma，M.，Inouye，T.，Sekine，Y.，Fujiwara，T.，Kuroiwa，T。和Tanaka，K。（2009）。 R2R3型MYB转录因子CmMYB1是 Cyanidioschyzon merolae的中心氮同化调节因子。 Proc Natl Acad Sci USA 106（30）：12548-12553。
Imamura，S.，Terashita，M.，Ohnuma，M.，Maruyama，S.，Minoda，A.，Weber，AP，Inouye，T.，Sekine，Y.，Fujita，Y.，Omata，T。和Tanaka ，K。（2010）。硝酸盐同化基因及其在单细胞红藻中的转录调控 Cyanidioschyzon merolae ：亚硫酸盐还原酶样酶对亚硝酸盐还原的遗传证据。植物细胞生理学 51（5）：707-717。
Kobayashi，Y.，Ohnuma，M.，Kuroiwa，T.，Tanaka，K。和Hanaoka，M。（2010）。单细胞红藻 Cyanidioschyzon merolae 的培养和分子遗传分析基础知识>。 Endocytobiosis Cell Res 20：53-61。
Matsuzaki，M.，Misumi，O.，Shin-I，T.，Maruyama，S.，Takahara，M.，Miyagishima，SY，Mori，T.，Nishida，K.，Yagisawa，F.，Nishida，K。， et al。（2004）。超小型单细胞红藻 Cyanidioschyzon merolae 10D的基因组序列。自然 428（6983）：653-657。
Minoda，A.，Sakagami，R.，Yagisawa，F.，Kuroiwa，T。和Tanaka，K。（2004）。通过红藻中的同源重组改善培养条件和核转化证据， Cyanidioschyzon merolae 10D。植物细胞生理学 45（6）：667-671。
Ohnuma，M.，Yokoyama，T.，Inouye，T.，Sekine，Y。和Tanaka，K。（2008）。聚乙二醇（PEG）介导的红藻中的瞬时基因表达， Cyanidioschyzon merolae 10D。植物细胞生理学 49（1）：117-120。
Shimogawara，K.，Fujiwara，S.，Grossman，A。和Usuda，H。（1998）。通过电穿孔高效转化莱茵衣藻。 Genetics > 148（4）：1821-1828。
Takemura，T.，Imamura，S.，Kobayashi，Y。和Tanaka，K。（2018）。选择性标记物回收系统的构建以及单细胞红中多个核基因的表位标记的用途alga Cyanidioschyzon merolae 。植物细胞生理学 59（11）：2308-2316。
Takemura，T.，Imamura，S.，Kobayashi，Y。和Tanaka，K。（2019）。引入DNA片段的制备，用于多细胞红藻 Cyanidioschyzon merolae 中染色体基因座的多重修饰。生物协议（审查中）。
Zienkiewicz，M.，Krupnik，T.，Drożak，A.，Golke，A。和Romanowska，E。（2017a）。氯霉素乙酰转移酶 - 红藻 Cyanidioschyzon merolae稳定核转化中的新选择标记。 Protoplasma 254（1）：587-596。
Zienkiewicz，M.，Krupnik，T.，Drożak，A.，Golke，A。和Romanowska，E。（2017b）。 Cyanidioschyzon merolae 叶绿体基因组的转化：了解叶绿体功能的前景极端环境。 Plant Mol Biol 93（1-2）：171-183。
Zienkiewicz，M.，Krupnik，T.，Drożak，A.，Wasilewska，W.，Golke，A。和Romanowska，E。（2018）。删除 Cyanidioschyzon merolae 中的psbQ'基因揭示了其功能PSII中的外在PsbQ'。 Plant Mol Biol 96（1-2）：135-149。