材料和试剂

移液器吸头
96孔板
阅读1：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG（建议来源：IDT的定制订单）
阅读2：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG（建议来源：IDT的定制订单）
TBE缓冲液：从10x TBE中提取1倍（建议来源：Fisher Scientific的Tris-borate-EDTA Buffer，目录号：B52）
Nextera DNA文库制备试剂盒（24个样品）（建议来源：Illumina，目录号：FC-121-1030）
Nextera Index Kit（96 Indices）（建议来源：Illumina，目录号：FC-121-1012）
Phusion Hot Start II高保真PCR Master Mix（Thermo Fisher，目录号：F565L）
UltraPure TM 0.5 M EDTA，pH 8.0（建议来源：Thermo Fisher，目录号：15575020）
注意：将10倍稀释液作为工作原液（100 mM）。
20x EvaGreen（Biotium，目录号：31000）
Agencourt AMPure XP（Beckmen Courtier，目录号：A63882）
Proteinase K，Molecular Biology Grade（New England Biolabs，目录号：P81075）
Chymostatin（5 mg）（Sigma-Aldrich，目录号：C7268-5MG）
注意：溶于0.83 ml DMSO中，制成6 mg / ml原液。
双蒸H 2 O（ddH 2 O）
DMSO（二甲基亚砜）
乙醇，新鲜生产75％乙醇，用于Agencourt AMPure XP洗涤
Tris-HCl，1M，pH 8（建议来源：Thermo Fisher，目录号：AM9856）
MgCl 2 ，1M（建议来源：Thermo Fisher，目录号：AM9530G）或
DMF（二甲基甲酰胺）
CLOROX漂白剂
5x转座酶缓冲液（见食谱）

设备

移液器
无DNA罩
Veriti TM 96孔热循环仪（Thermo Fisher，目录号：4375786）
QuantStudio 3实时PCR系统（Thermo Fisher）
DynaMag TM -96 Side Magnet（Thermo Fisher，目录号：12331D）
Agilent BioAnalyzer

程序

该文库制备程序以96孔板开始，每个孔含有5μlTBE或ddH 2 O中的一个细胞。（根据制造商的手册或通过手动方式[Knouse et al。，2017]，可以用细胞分选器除去单细胞）。整个工作流程如下表所示：
向每个孔中加入3μl含有1μl5x转座酶缓冲液，0.5μl蛋白酶K（NEB）和1.5μlH 2 O的溶液。旋转以确保蛋白酶溶液进入细胞悬浮液。将悬浮液在55℃孵育5小时以打开细胞并除去组蛋白，然后在65℃孵育20分钟以使蛋白酶K变性。＆nbsp;
向每个孔中加入1μl1.5mg/ ml的胰凝乳蛋白酶抑制剂，旋转，在室温下孵育10分钟以灭活剩余的蛋白酶K活性。
添加1.5μl含有1μl5x转座酶缓冲液和0.5μl来自Illumina的Nextera DNA文库制备试剂盒的Tagment DNA酶（TDE）的溶液。旋转下来。
将标记反应保持在55℃下20分钟。
加入1μl含有0.5μl100mM EDTA和0.5μl蛋白酶K的溶液。涡旋并旋转。在37°C孵育1小时，然后在65°C孵育20分钟。
向每个孔中加入12.5μl的2x热启动Phusion Master Mix和1.25μl的100μMRead1和Read2。充分混合，并运行以下PCR方案：65°C 30分钟，95°C 2分钟，然后6个循环，15秒，98°C，30分钟，65°C，加上7个循环，15秒，98秒°C，65°C下3分钟。热循环方案总结在下表中：
PCR后，根据制造商的说明添加45μlAmpure珠粒以纯化PCR产物。洗脱10μlddH 2 O并用18μlAMPure珠纯化，然后在10μlddH 2 O中洗脱。详细步骤列于下表：
使用来自最后一步的2.5μl进行20μl样品条形码PCR，其包含1x热启动Phusion Master Mix，1x EvaGreen，1μM，每种5xx和7xx条形码用于Illumina测序，每个细胞一对独特。通过在95℃加热2分钟进行扩增，然后在85℃下15秒和65℃下3分钟之间进行8个循环。任选地在65℃下监测反应。热循环方案总结在下表中：
根据制造商的说明使用36μl的AMPure珠子纯化条形码产物，并在10μlddH 2 O中洗脱。
取1μl进行BioAnalyzer分析。
如果配置文件和产量均符合要求（参见注释），则可以使用Illumina的系统进行测序。

笔记

对于单细胞操作，避免污染和交叉污染至关重要（Knouse et al。，2017）。我们在移液时使用无DNA罩，并立即将移液管吸头浸入并浸入约1％的漂白水中，以尽量减少交叉污染的可能性。
饱和转座（步骤5）对于该程序是至关重要的（Xi et al。，2017）。饱和转座可最大限度地减少转座酶的序列偏倚。＆nbsp;
尼克翻译（步骤7）对于生成可以扩增文库的“标签”是必要的。来自Hot-start Phusion Master Mix的聚合酶活性在65°C时足够渗漏，以根据制造商的说明完成任务。
我们使用EvaGreen监测条形码反应中每个单细胞文库的扩增（步骤9）。荧光显着增加从第4周期开始。＆nbsp;
我们在BioAnalyzer上分析每个单细胞库（步骤11）。我们使用配置文件来评估我们的程序。首先，文库的浓度反映了（1）起始DNA的量和（2）扩增效率。从6pg DNA开始，我们预计对于10μl体积的文库，浓度至少为10nM。与实时PCR扩增曲线一起使用，我们可以优化细胞裂解步骤和扩增。其次，我们期望在饱和转置下构建的文库的轮廓看起来如图1的左图所示。该轮廓与Illumina推荐的批量测序不同。片段大小最好在170到350个碱基对之间（Xi et al。，2017）。有几个因素可能导致扁平剖面，如图1右图所示：（1）组蛋白去除不充分，（2）转座酶量不足，（3）步骤2和3中蛋白酶K不完全变性，导致步骤5中转座酶的降解，（4）步骤6中转座子的不完全去除。较大的片段具有相对较低的效率，可通过Illumina的系统进行测序（Xi et al。，2017），导致计数不足这些地区。

图1.除定量外，使用BioAnalyzer检查转座是否饱和（左图）或不饱和（右图）
BioAnalyzer分析后，可以调整文库浓度以进行下一代测序。基因组的0.5％x至5％x的测序深度对于CNV分析是有益的。分辨率（即，bin大小）取决于每个bin的唯一片段（计数）的数量。要获得统计上合理的拷贝数调用，我们每个bin使用至少50个计数。例如，如果预期的分辨率是1,000千碱基，对于平均插入物大小为100个碱基的文库，最小覆盖度=（50个计数×100个碱基）/ 1,000,000个= 0.5％。如果分辨率设置为100千碱基，则最小覆盖率=（50个计数×100个碱基）/ 100,000 = 5％。＆nbsp;
我们已经在K562细胞系，BJ，人淋巴细胞GM01202细胞系，人肠细胞，人皮肤细胞，小鼠皮肤细胞和小鼠脑细胞的单细胞上使用该方案。

食谱

5x转座酶缓冲液（Picelli et al。，2014）
在25°C下加入50 mM Tris-HCl，25 mM MgCl 2 ，50％（v / v）DMF（pH 8.0）

利益争夺

Digenomix正在将该技术商业化。

参考

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