材料和试剂

Labwares
1. 移液器吸头，10μl和200μl（Gilson，Diamond tips D10和D200，目录号：F161630和F161930）
2. 锥形聚丙烯离心管，15 ml和50 ml（Thermo Fisher，Nunc，目录号：339650和339652）
3. 1.5毫升聚丙烯管（Eppendorf，3810X，目录号：0030125150）
4. 手套（Ansell，Microflex，目录号：NPG-INT）
OST蛋白和两种底物
1. Oligosaccharyltransferase酶，从天然来源分离或重组表达，在洗涤剂存在下纯化（参见制备说明）
2. 糖供体LLO，（部分）从培养细胞中纯化（参见制备说明）
3. 含有氨基酸序列中N-糖基化序列的糖受体肽和附着在N-或C-末端用于检测的荧光染料（见设计和制备注释）
试剂，溶液和缓冲液
1. 预制PAGE凝胶，15％-25％梯度凝胶（尺寸85 x 90 x 0.9 mm 3 ）（Cosmo Bio，MULITGEL II Mini 15/25（17W），目录号：DCB-414923）
2. Trizma碱[三（羟甲基）氨基甲烷]（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
3. HCl（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
4. MgCl 2 六水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
5. MnCl 2 四水合物（Sigma-Aldrich，目录号：221279）
6. 二硫苏糖醇（DTT）（西格玛奥德里奇，目录号：43819）
7. 吐温20（西格玛奥德里奇，目录号：P1379）
8. 冻干肽粉（定制订单，TORAY）
9. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
10. N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）（DOJINDO，目录号：D316）
11. 氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
12. 甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
13. SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
14. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
15. 溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
16. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）
17. （可选）EDTA（乙二胺四乙酸）（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）
18. 10：10：3（v / v / v）氯仿：甲醇：水（见食谱）
19. 5x SDS-PAGE样品上样缓冲液（参见配方）
20. 运行电泳缓冲液（参见食谱或Sigma-Aldrich，10x浓缩液，目录号：T7777-1L）

设备

微量移液管（Gilson，Pipetman P2，P20，P200，目录号：F144801，F123600，F123601）
电子移液器（Gilson，Pipetman P10M，P100M，目录号：F81022，F81013）
4°C冰箱（PHC，MPR-1014）
冷藏实验室台式离心机（Eppendorf，Centrifuge 5418R，目录号：5401000030）
水浴式超声波仪（Branson，Bransonic 2800超声波清洗机）
用于1.5 ml管的铝加热/冷却块（Sigma-Aldrich，目录号：Z740272-1EA）
孵化器，自然对流烤箱或强制气流对流烤箱（YAMATO，IC402，目录号：211195或EYELA，NDO-420或WFO-420，目录号：252240或252280）
注意：或者，可以使用水浴式培养箱和PCR设备。
可承受有机溶剂的真空浓缩器（Thermo Fisher，Savant SpeedVac SPD120P1，目录号：SPD120P1-115 / 230）＆nbsp;
用于PAGE的盒式电泳装置（Cosmo Bio，型号DPE-1020用于迷你凝胶，DCB-303111）
PAGE电源（Bio-Rad，PowerPac Basic，目录号：1645050）
LAS-3000多色凝胶图像分析仪（富士胶片）
1. LED（绿色520 nm EPI）照明器（用于TAMRA染料）和LED（蓝色460 nm EPI）照明器（用于5-CF / 5-FAM染料）
2. 575DF20滤波器（用于TAMRA）和Y515-Di滤波器（用于5-CF / 5-FAM）
3. 虹膜0.85
注意：或者，可以使用其他凝胶成像仪：例如，Amersham Imager 680 RGB系统（GE）和带有Spectra-Pad RGB选项的Fusion Solo 7S（Vilber）。
空气（气体）除尘器（Orientech，目录号：AD400FL）
通风橱（Yamato Scientific，目录号：RFS-120SZ）
-20°C冰箱（PHC，目录号：MDF-MU500H-PJ）

软件

ImageGauge软件（富士胶卷）
注意：或者，可以使用安装在其他凝胶成像仪中的任何软件。

程序

寡糖转移反应
1. 反应缓冲溶液的制备
  将以下试剂混合在1.5 ml聚丙烯管中：
  10μl1MTris-HCl，pH 7.5
  20μl100mMMnCl 2
  2μl100mM DTT
  168μl0.1％（v / v）Triton X-100或0.1％（w / v）DDM（正十二烷基-β-D-麦芽糖苷）
  总体积为200μl
  注意：在原始协议中，使用0.02％（v / v）吐温20（Kohda 等，2007）。我们现在经常使用Triton X-100或DDM来更好地溶解LLO。可以用MnCl 2
2. LLO的增溶
  1. 以10：10：3（v / v / v）氯仿：甲醇：水计算的LLO原液的体积为10μl（相当于0.1-10pmol的LLO）x“样品数加 1个额外的塑料管“。对于定量实验，推荐的LLO量为10pmol /10μl。考虑到一个PAGE凝胶的泳道数，通常的样品数在10到20的范围内。＆nbsp;
  2. 将LLO溶液转移到1.5 ml聚丙烯管中，并在SpeedVac浓缩器中干燥。温度设定在30°C至37°C之间。
  3. 将反应缓冲溶液加入管中的干燥LLO中。反应缓冲溶液的体积通过8μlx“样品数量加上 1塑料管额外”来计算。＆nbsp;
  4. 在室温下以连续模式在浴式超声波仪中超声处理溶液5分钟，并剧烈涡旋以溶解LLO。＆nbsp;
  5. 在4,000℃下离心16,000 x g ，5分钟，以除去不溶物质。＆nbsp;
  6. 将上清液转移到新管中，并将去污剂溶解的OST加入上清液中。洗涤剂溶解的OST的体积通过1μl（对应于0.01-1pmol的酶）×“样品的数量加上 1的塑料管的额外”来计算。＆nbsp;
  7. 将9μl等份的上清液移液到1.5ml聚丙烯管中，在冰上预冷。强烈建议使用电子移液器进行精确点胶。
3. 开始和停止反应
  1. 向每个聚丙烯管中加入3μl（相当于30pmol）10μMTAMRA-受体肽溶液。这允许进行时程分析和肽文库实验。短暂离心以旋转内容物，用手指轻敲管子几次以进行混合，然后再次离心。
  2. 将管放在冰上。在大量管的情况下，使用铝加热/冷却块方便1.5毫升管。＆nbsp;
  3. 将管（在铝块中）转移到培养箱中。在所需温度下孵育（酵母和 Campylobacter OSTs为30°C，65°C为来自嗜热古菌的热稳定OSTs）。应在与进展曲线的线性部分相对应的时间范围内选择孵育时间，以测量反应的初始速率（图3）。典型的孵育时间为30分钟至2小时。在高温下，重要的是均匀加热管子以防止管子内部的水蒸发和冷凝。在黑暗中的反应是希望避免荧光猝灭，但不是强制性的。
  4. 使用自然对流或强制气流对流烤箱或PCR设备。通过向每个管中加入3μl5xSDS-PAGE样品上样缓冲液，并在95℃下加热1分钟来终止反应。＆nbsp;
  5. 短暂离心管以旋转内容物。任选地，在加入SDS-PAGE样品上样缓冲液之前，加入终浓度为5-10mM的EDTA（乙二胺四乙酸），以立即停止反应。请注意，将管（在铝块中）放置在冰上有时不足以完全阻止反应。
    
    图3.糖肽生成的时间过程。 A.通过SDS-PAGE将糖肽产物与未修饰的肽分离，并通过荧光成像定量。荧光染料附着在肽上。标明了蛋白质标准物和染料前沿的位置。用S形色调曲线调节对比度。该凝胶图像改编自（Matsumoto 等人，2013）。 B.糖肽产品的量随时间的变化应产生直线用于定量测量。
电泳
在SDS存在下的加热对于（糖）肽的PAGE分离不是必需的，但是可以通过其对反应混合物溶液中的各种蛋白质的变性作用来澄清迁移图像。
＆NBSP;将整个体积（15μl）加载到SDS-PAGE凝胶上。如果样品体积因任何原因而减少，可添加少量水或缓冲液，但请记住，必须将整个样品装入其中一个凝胶孔中。在恒定电流模式下以每凝胶约23mA进行电泳约75分钟。最佳恒定电流低于用于分离多肽的标准电流，30-40mA。适当设定电流对于糖肽产物与未反应肽的良好分离至关重要。作为指导原则，电泳时间设定为溴酚蓝（BPB）前线，以达到凝胶底部上方约1cm。应避免凝胶用完，因为未反应的肽会在染料前线附近迁移。不推荐在凝胶上同时运行预染色的分子量标记物，因为一些染色染料是荧光的。
＆NBSP;使用手工制备的聚丙烯酰胺凝胶与4％丙烯酰胺（AA）/双丙烯酰胺（双）堆积凝胶和20％AA / bis分离凝胶，或预制聚丙烯酰胺凝胶与4％AA / bis堆积凝胶和15％-25％梯度AA / bis分离凝胶。高AA / bis百分比对于糖肽和肽之间的分离是重要的。通常，预制凝胶优于手工凝胶，因为凝胶的质量更均匀。应该使用夹在玻璃板之间的凝胶，因为塑料板由于光吸收而使荧光成像变得困难。
＆NBSP;通常使用基于Tris-甘氨酸缓冲系统的Laemmli-SDS-PAGE。或者，基于Tris-Tricine缓冲系统的Tricine-SDS-PAGE对于更好地分离糖肽是有效的。事实上，只有一个单糖残基的肽可以从未修饰的肽中分离出来（Gerber et al。，2013）。人们应该采取预防措施，但糖肽的流动性可能会受到糖成分和分支模式的影响。
通过凝胶内荧光成像检测
使用荧光成像仪在凝胶中显现（Glyco）肽。不必将玻璃板从凝胶上分离。
1. 电泳完成后，立即用水清洗玻璃板，然后用乙醇清洗。＆nbsp;
2. 用空气（气体）除尘器吹掉残留的乙醇。不要使用纸巾或布，因为擦拭痕迹会留在玻璃板上。＆nbsp;
3. 按照手册中的说明设置荧光成像仪。对于带有TAMRA荧光团的LAS-3000多色图像分析仪（富士胶片），使用精密模式，标准灵敏度，绿色LED（绿色520 nm EPI）照明器，575DF20滤光片和Iris 0.85。典型的曝光时间为1至60秒。原则上，必须针对任何糖基化来优化暴露时间，并且不应过度暴露非糖基化条带以准确定量条带。
4. 可能的阴性对照包括在反应混合物中省略去污剂溶解的OST或LLO。相反，可以使用含有非功能性序列，NPT或NPS的肽。相反，阳性对照的制备并不容易，因为糖肽的化学合成是困难且昂贵的。或者，在从产物条带中凝胶提取后，使用MALDI-TOF-MS或ESI-MS进行质量分析是鉴定底物肽的糖基化的最佳方法。

数据分析

SDS-PAGE凝胶的典型荧光图像显示在图4中。品红色表示荧光强度的饱和度。具有低效sequons的肽文库实验需要长的暴露时间来检测糖肽产物条带。注意在电泳期间具有不同氨基酸序列的肽和糖肽的迁移速率的微小变化。
＆NBSP;选择（糖）肽的带边界以获得荧光强度，并且平行地选择具有相同区域的空白边界以减去背景噪声。 ImageGauge软件（Fuji Film）有一个特殊的手绘工具，可以用自由曲线设置带边界和空白边界（图4C）。
＆NBSP;为了通过荧光成像确定（糖）肽的绝对量，可以使用具有TAMRA荧光团的任何肽来制备标准校准曲线。在制备TAMRA-肽的连续稀释液时必须小心，以避免吸附在塑料管上：首先应将其与SDS-PAGE样品上样缓冲液混合，然后稀释。或者，添加少量吐温20（0.02％）可有效防止塑料管吸附。

图4. N-糖基化序列的第二位氨基酸取代对寡糖转移反应效率的影响。 A.在（伊古拉）进行肽库实验的原始荧光图像和Kohda，2011a）。星号显示未识别的条带，其仅在TAMRA荧光团通过硫醇 - 马来酰亚胺反应与肽连接时出现。当TAMRA荧光团通过酰胺键形成直接连接到N-末端氨基时，不会出现额外的条带（如 m 标记的 lanes 所示）。 B.图1A中的部分（Igura和Kohda，2011a）被重新显示以供参考。 C.对于背景校正，通过ImageGauge软件（Fuji Film）的徒手工具选项设置带边界和空白边界。用S形色调曲线调节对比度。

笔记

寡糖基转移酶
动物，植物和真菌OST是由8种不同的膜亚基蛋白组成的多亚基蛋白复合物（Larkin和Imperiali，2011）。相反，低等真核原生动物OST是仅由催化亚基组成的单亚基酶，并且被称为 Stt3 。古细菌和真细菌OST也是单亚基酶，分别由AglB和PglB组成。尽管催化亚基具有不同的名称，但它们具有共同的祖先并且共享几个保守的短氨基酸序列基序。每个基因组通常编码催化亚基（和其他亚基）的多个旁系同源基因。因此，使用合适的宿主细胞制备重组OST蛋白质更好。例如， Pyrococcus 的OST蛋白（Igura和Kohda，2011b）， Archaeoglobus （Matsumoto et al。，2013）和 Campylobacter （Maita et al。，2010; Gerber et al。，2013）在 E的膜组分中成功表达。大肠杆菌细胞。在特殊情况下，酵母基因组仅编码一个 Stt3 基因。酵母OST复合物（含有Ost3或Ost6亚基）可以从酵母细胞制备（Harada 等人，，2013）。或者，可以通过多克隆抗体纯化来自天然来源的粗膜级分的一种旁系同源OST蛋白，例如激烈热球菌（Pyrococcus furiosus），（Igura 等，，2008）。多克隆抗体可以通过用对应于 E中表达的C末端可溶结构域的片段免疫兔来获得。大肠杆菌细胞。
＆NBSP;为了制备大量的糖肽产物，可以使用由任何培养细胞制备的含有野生型OST和LLO的粗膜组分。粗膜级分的去污剂溶解有效地改善了膜级分的储存寿命。注意，洗涤剂的选择对于LLO溶解是至关重要的。为了制备酵母和古细菌膜级分，Triton X-100优于洋地黄皂苷或DDM用于OST和LLO的共溶解。与受体肽一起温育容易产生糖肽产物。由于水溶性化合物（例如核苷酸糖）从膜级分中洗去，因此不会发生严重的副反应，例如O-糖基化。我们遇到的一个副反应是C-末端α-酰胺基团的脱氨基。建议添加蛋白酶抑制剂，即使天冬酰胺上的寡糖链有效保护糖肽不受蛋白酶消化。在肽合成期间掺入生物素组有助于纯化大量糖肽（Fujinami et al。，2017）。
糖供体LLO
描述了酵母的粗制LLO制剂（Kelleher et al。，2001），原生生物（Samuelson et al。，2005）， Pyrococcus （Igura） et al。，2008）， Archaeoglobus （Matsumoto et al。，2013）， Haloferax （Guan et al。，2010）和 Campylobacter （Maita et al。，2010; Gerber et al。，2013）。简而言之，通过离心收获的培养细胞被玻璃珠或超声破碎，并通过离心除去细胞碎片。任选地，将上清液在100,000×gg / ml下超速离心，并将膜沉淀重悬于缓冲液中。氯仿：甲醇：水体系的两相分配产生粗LLO馏分。提取的粗LLO可以通过阴离子交换色谱法在氯仿：甲醇：水溶剂系统中进一步纯化，然后通过NP-HPLC（正相高效液相色谱法）使用氯仿：甲醇：水：NH 4进一步纯化。 OH溶剂系统（Guan et al。，2010; Taguchi et al。，2016）。将溶解在氯仿：甲醇：水中的粗制和纯化的LLO储存在-20℃的玻璃容器中直至使用。
糖受体肽
1. 糖受体肽的设计
  糖受体肽通常通过定制肽合成制备。通常，它由含有N-糖基化序列，Asn-X-Thr或Asn-X-Ser（X≠Pro）的3至10个氨基酸残基组成。如果N-末端α-氨基和C-末端α-羧基分别被乙酰基和酰胺基封闭，则仅对应于N-糖基化序列的三个残基可用作底物。在最初的报告中（Kohda et al。，2007），（TAMRA）-Gly- Asn-Ser-Thr -Val-Thr-NH 2 ，其中加下划线的序列是N-糖基化序列，用于酵母和 Pyrococcus OST的寡糖基转移测定。将下划线序列改变为Gln-Ser-Thr，Asn-Pro-Thr或Asn-Ser-Ala以测试N-糖基化序列作为阴性对照。真细菌 Campylobacter N-糖基化序列在-2位需要酸性残基Asp或Glu。（TAMRA）-Ala- Asp-Gln-Asn-Ala-Thr -Tyr-Lys-COOH和（5-CF）-Gly-Ser-up-Gln-Asn-Ala- Thr -Phe-NH 2 用于 Campylobacter OSTs（Maita et al。，2010; Gerber et al。，2013）。 5-CF代表5-羧基荧光素，别名为5-FAM。考虑到在酸性水溶液中的溶解度和通过RP（反相）-HPLC-ESI-MS（电子喷雾电离质谱法）的灵敏检测，推荐在肽序列中掺入赖氨酸和精氨酸残基。例如，（TAMRA）-Ala-Ala-Tyr-Asn-Val-Thr-Lys-Arg-（Lys-生物素）-COOH用于 Pyrobaculum OST （Fujinami et al。，2017）。
  ＆NBSP;为了使肽更好的底物，Thr优选在+2位置的Ser，并且Asp在-2位置优于Glu。 Pro必须避免在+1（X）位置，并且应避免在-1和+3位置。在+1（X）位置选择氨基酸残基对寡糖基转移活性具有高度影响。应测试几个氨基酸残基以选择最佳受体肽。例如，在体外测定条件下，Val是 Pyrococcus OST（Igura和Kohda，2011b），Glu和+1位置上最受青睐的氨基酸残基。 Gln最适合 Archaeoglobus OST（Matsumoto et al。，2017），Ala，Ser和带正电荷的残基是 Campylobacter OST（Chen et al。，2007）。同样，特定蛋白质中单个N-糖基化序列的实验分析表明，在补充了兔网膜细胞无翻译系统的微粒体中，+1位氨基酸变异对犬OST糖基化效率的显着影响（ Shakin-Eshleman et al。，1996; Kasturi et al。，1997）。相反，当肽与 Archaeoglobus OST蛋白交联时，+1位的强烈偏好消失了（Matsumoto et al。，2017），而不是在真核和古细菌糖基化位点的综合统计分析中检测到（Ben-Dor et al。，2004; Petrescu et al。，2004; Abu-Qarn和Eichler，2007 ）。
2. 糖受体肽
  1. 糖受体肽的设计
    糖受体肽通常通过定制肽合成制备。通常，它由含有N-糖基化序列，Asn-X-Thr或Asn-X-Ser（X≠Pro）的3至10个氨基酸残基组成。如果N-末端α-氨基和C-末端α-羧基分别被乙酰基和酰胺基封闭，则仅对应于N-糖基化序列的三个残基可用作底物。在最初的报告中（Kohda et al。，2007），（TAMRA）-Gly- Asn-Ser-Thr -Val-Thr-NH 2 ，其中加下划线的序列是N-糖基化序列，用于酵母和 Pyrococcus OST的寡糖基转移测定。将下划线序列改变为Gln-Ser-Thr，Asn-Pro-Thr或Asn-Ser-Ala以测试N-糖基化序列作为阴性对照。真细菌 Campylobacter N-糖基化序列在-2位需要酸性残基Asp或Glu。（TAMRA）-Ala- Asp-Gln-Asn-Ala-Thr -Tyr-Lys-COOH和（5-CF）-Gly-Ser-up-Gln-Asn-Ala- Thr -Phe-NH 2 用于 Campylobacter OSTs（Maita et al。，2010; Gerber et al。，2013）。 5-CF代表5-羧基荧光素，别名为5-FAM。考虑到在酸性水溶液中的溶解度和通过RP（反相）-HPLC-ESI-MS（电子喷雾电离质谱法）的灵敏检测，推荐在肽序列中掺入赖氨酸和精氨酸残基。例如，（TAMRA）-Ala-Ala-Tyr-Asn-Val-Thr-Lys-Arg-（Lys-生物素）-COOH用于 Pyrobaculum OST （Fujinami et al。，2017）。
    ＆NBSP;为了使肽更好的底物，Thr优选在+2位置的Ser，并且Asp在-2位置优于Glu。 Pro必须避免在+1（X）位置，并且应避免在-1和+3位置。在+1（X）位置选择氨基酸残基对寡糖基转移活性具有高度影响。应测试几个氨基酸残基以选择最佳受体肽。例如，在体外测定条件下，Val是 Pyrococcus OST（Igura和Kohda，2011b），Glu和+1位置上最受青睐的氨基酸残基。 Gln最适合 Archaeoglobus OST（Matsumoto et al。，2017），Ala，Ser和带正电荷的残基是 Campylobacter OST（Chen et al。，2007）。同样，特定蛋白质中单个N-糖基化序列的实验分析表明，在补充了兔网膜细胞无翻译系统的微粒体中，+1位氨基酸变异对犬OST糖基化效率的显着影响（ Shakin-Eshleman et al。，1996; Kasturi et al。，1997）。相反，当肽与 Archaeoglobus OST蛋白交联时，+1位的强烈偏好消失了（Matsumoto et al。，2017），而不是在真核和古细菌糖基化位点的综合统计分析中检测到（Ben-Dor et al。，2004; Petrescu et al。，2004; Abu-Qarn和Eichler，2007 ）。
    ＆NBSP;在最初的报道中，TAMRA（羧基四甲基罗丹明，吸收/发射，555nm / 580nm）在定制肽合成期间与N-末端α-氨基连接（Kohda等人，2007）。通常，TAMRA荧光团是两种异构体，5-和6-羧基四甲基罗丹明的混合物，并且携带5-和6-异构体的肽在RP-HPLC色谱图中分成两个峰。我们发现TAMRA肽的缓慢洗脱峰在OST测定中产生更清晰的SDS-PAGE背景。如果荧光凝胶内图像的背景高，则应使用另一种携带异构体的肽，以避免在RP-HPLC纯化过程中污染不需要的荧光杂质。代替在肽合成期间掺入TAMRA或另一种荧光染料，可以在肽序列中掺入另外的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基的巯基（SH）基团可用作通过硫醇 - 马来酰亚胺反应进行荧光标记的锚定点（图4）。＆nbsp;
  2. 受体肽溶液的制备
    将冻干的肽粉末溶解在水中。肽溶液的pH非常酸性（pH <3）。通过连续添加少量碱性溶液（，例如，1M NaOH）中和酸性溶液。使用pH试纸就足够了。将浓缩的肽溶液（10mM）以方便大小的等分试样储存在-20℃或-80℃。为了制备工作储备溶液，用0.02％吐温20将原料浓度稀释至10-100μM。工作储备溶液可以在4℃下在冰箱中储存长达数周。然而，长期冷藏储存导致降解，并且可能在SDS-PAGE凝胶的荧光图像中产生高背景水平。
    ＆NBSP; TAMRA-肽的浓度通过555nm处的吸光度确定，在水溶液中消光系数为90,000M -1 cm -1 。例如，10μM的TAMRA荧光团对应于555nm处的0.9的吸光度。 5-CF（别名 5-FAM） - 肽的浓度由495 nm处的吸光度决定，消光系数为79,000 M -1 cm -1 在水溶液中。
食谱
1. 10：10：3（v / v / v）氯仿：甲醇：水
  1. 测量并混合玻璃容器中的所有溶剂，因为氯仿会溶解塑料
  2. 将溶液储存在加盖的玻璃容器中，以防止由于氯仿和甲醇蒸发引起的浓度变化
  注意：处理氯仿时，务必戴上手套并使用通风橱，因为它有毒。
2. 5x SDS-PAGE样品上样缓冲液
  0.25M Tris-HCl，pH 6.8
  5％SDS
  50％（w / v）甘油
  0.125％（w / v）溴酚蓝
  在室温下储存工作等分试样。 SDS的最终百分比不应超过1％以避免谱带展宽
3. 运行电泳缓冲液
  0.025M Tris-HCl，pH8.3
  0.192 M甘氨酸
  0.1％SDS
致谢

这项工作得到了JSPS KAKENHI Grants JP15083205和JP26119002（DK）的支持。

利益争夺

作者声明没有潜在的利益冲突。

参考
1. Abu-Qarn，M。和Eichler，J。（2007）。对古菌糖蛋白序列周围氨基酸序列的分析。 Archaea 2（2）：73-81。
2. Bause，E。和Hettkamp，H。（1979）。大鼠肝脏中肽的N-糖基化的主要结构要求。 FEBS Lett 108（2）：341-344。
3. Ben-Dor，S.，Esterman，N.，Rubin，E。和Sharon，N。（2004）。蛋白质N-糖基化位点侧翼残基的偏倚和复杂模式。糖生物学 14（2）：95-101。
4. Chen，M.M.，Glover，K。J.和Imperiali，B。（2007）。从肽到蛋白质： C中N-连接糖基化的底物特异性的比较分析。 jejuni 。 Biochemistry 46（18）：5579-5585。
5. Cherepanova，N.，Shrimal，S。和Gilmore，R。（2016）。内质网的N-连接糖基化和稳态。 Curr Opin Cell Biol 41：57-65。
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7. Geetha-Habib，M.，Park，H.R。和Lennarz，W.J。（1990）。体内 N-糖基化和Asn-X-Ser /的命运三肽。 J Biol Chem 265（23）：13655-13660。
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