材料和试剂

2和1.5毫升Eppendorf管（Hounisen，目录号：72.695.500和72.706）
15毫升猎鹰管
Zeba Spin Desalting Columns 7KMWCO（Thermo Scientific，目录号：89890）
使用寡核苷酸
1. S上。 pombe spike-in
  ACT1_ S上。 pombe _fwd CCATTCTTGCTTCTCTTTCTACTTTCC（Sigma-Aldrich，定制）
  ACT1_ S上。 pombe _rev CGCTCTCATCATACTCTTGCT（Sigma-Aldrich，定制）
2. S上。 cerevisiae pA + RNAs
  HHF1_fwd ACTGCCCGGTTTTTCTTCT（Sigma-Aldrich，定制）
  HHF1_rev CCTAAACCCGCTATAATACACTCAT（Sigma-Aldrich，定制）
  PMA1_fwd TACTGTCGTCCGTGTCTGGATCT（Sigma-Aldrich，定制）
  PMA1_rev CCTTCATTGGCTTACCGTTCA（Sigma-Aldrich，定制）
  TLC1_pA + _fwd TACTGTCGTCCGTGTCTGGATCT（Sigma-Aldrich，定制）
  TLC1_pA + _rev CCTTCATTGGCTTACCGTTCA（Sigma-Aldrich，定制）
3. S上。 cerevisiae 非多腺苷酸化的RNAs
  SCR1_fwd CCCGGCTATAATAAATCGATCT（Sigma-Aldrich，定制）
  SCR1_rev GCTGACGCTGGATAAAACT（Sigma-Aldrich，定制）
4-硫尿嘧啶（Sigma-Aldrich，目录号：440736）
干冰＆nbsp;
苯酚，pH 4.3（Sigma-Aldrich，目录号：P4682）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：32211）
醋酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S-8625）
柠檬酸钠（默克，目录号：1.06448）
氯化钠（默克，目录号：1.06404）
HEPES（西格玛奥德里奇，目录号：H3375）
Tris（VWR，目录号：103156X）
EDTA（默克，目录号：1.08418）＆nbsp;
磷酸氢二钠（默克，目录号：1.06575）
磷酸二氢钠（默克，目录号：1.06345）
SDS（AppliChem，Panreac，目录号：A1112）
氯化镁（默克，目录号：1.05833）
糖原（20 mg / ml）（Sigma-Aldrich，目录号：G1508）（-20°C保存）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
MTSEA-生物素（Biotium，目录号：90064）
二甲基甲酰胺（DMF）（默克，目录号：1.03053）
TURBO DNase免费套件（Ambion，目录号：AM1907M）
SuperScript II（Invitrogen，目录号：18064-014）
Platinum SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG试剂盒（Invitrogen，目录号：11733-046）
大肠杆菌 poly（A）聚合酶试剂盒（Thermo Fisher，目录号：AM1350）
PureLink微RNA纯化试剂盒（Ambion，目录号：12183018A）
Ribo-Zero Gold rRNA酵母去除试剂盒（Illumina，目录号：MRZY1306）
RiboLock RNase Inhibitor（Thermo Scientific，目录号：E00381）
Lexogen QuantSeq 3'mRNA-Seq文库制备试剂盒REV（Lexogen，目录号：016.96）
Dynabeads MyOne Streptavidin C1（Invitrogen，目录号：65002）
乙醇96％（VWR，目录号：83804）
KOH（默克，目录号：P5958）
SC氨基酸混合物（默克，目录号：Y1501;或自制等效物）
酵母氮碱（默克，目录号：Y0626）
DMSO（默克，目录号：W387520）
YPAD生长培养基（默克，目录号：Y1375;或自制等同物）
乙酸（默克，目录号：1005706）
NaOH（默克，目录号：S8045）
HCl（默克，目录号：H1758）
URA - 培养基（不含尿嘧啶的合成生长培养基）（见食谱）
4tU库存（见食谱）
TES（见食谱）
S上。 pombe 加标RNA（见食谱）
RNA储存解决方案（见食谱）
3 M NaOAc（见食谱）
MTSEA-生物素原料（见食谱）
1 M HEPES-KOH，pH 7.5（参见食谱）
0.5 M EDTA-NaOH，pH 8（参见配方）
1 M NaPi缓冲液，pH 6.8（参见食谱）
10x NaMg（见食谱）
1x NaMgPS（见食谱）
TEN1000（见食谱）
0.7Mβ-巯基乙醇（见食谱）
20毫克/毫升糖原（见食谱）

设备

DynaMag-2磁铁（赛默飞世尔科技，目录号：12321D）
培养箱（30°C，搅拌500 ml烧瓶）
离心机（50毫升管）
微量离心机（冷却，用于Eppendorf管）
Thermomixer（用于Eppendorf管，加热至65°C）＆nbsp;
旋转轮＆nbsp;
实时PCR系统（Agilent，型号：AriaMX，目录号：G8830A）
生物分析仪（安捷伦，型号：Bioanalyzer 2100）
Qubit 2.0荧光计（Life Technologies）
NanoDrop紫外分光光度计
离心桶（或烧瓶）
高压灭菌器
涡流混合器
4°C冰箱
-20°C冰柜
-70°C冰柜

程序

S的代谢标记。 cerevisiae 文化
1. 准备96％乙醇以快速灭活细胞。在离心桶（或烧瓶）中准备每种培养物1x培养体积的乙醇，其可容纳2.5倍或更多的培养物体积。将这些烧瓶预先冷却至-70°C左右，放入装有大量干冰的盒子中。＆nbsp;
2. 在URA - 培养基中使用100 ml培养物进行标准实验。
3. 使细胞生长至0.4至0.8的光密度（OD 600 ）。
4. 加入1 / 10,000培养体积的100mM 4tU（，，终浓度10μM）并充分混合。
  注意：如果您并行处理多种培养物，请准备并遵循确切的时间表，以便能够精确地遵循所需的标记时间。请记住准备一种未经过4tU处理的培养物（阴性对照）并将其作为其他样品处理。
5. 继续生长所需的代谢标记时间（通常2分钟以强烈富集新生RNA）。
  注意：标记时间可以通过测试几个时间点来优化，例如，1,2,5和10分钟，并比较所需目标的浓缩度（参见 [可选]质量控制部分）
6. 通过将培养物倒入步骤A1中制备的1x体积的深冷乙醇中快速灭活细胞。在正常冰上放置，直到所有样品都准备好离心。
  注意：这种方法背后的想法是，简单地将细胞置于冰上等将使代谢活动持续不可控制的时间，而倒入深冷乙醇将立即停止所有活动并允许精确控制标记时间。
7. 在1℃下以1,500 x g 旋转3分钟。
8. 除去上清液，重悬于3ml冰冷的ddH 2 O中，并将悬浮液分成3×2ml Eppendorf管。
9. 在Eppendorf管中全速旋转细胞12秒，并用1ml冰冷的ddH 2 O洗涤细胞另外2轮。
10. 小心地去除上清液。将沉淀储存在-70°C或继续RNA提取。
提取总RNA
注意：上述3个等分试样分别处理，本节中的所有酚化和沉淀均在2 ml管中完成。每个样品需要15管。
1. 将细胞重悬于800μlTES中。加入800μl酸性酚，在65℃下在热混合器中剧烈振荡1小时。
2. 全速和4°C旋转5分钟。将顶部相转移至新管并通过在65℃下在加热块中剧烈摇动5分钟，用另外700μl酸性酚酚化。
3. 如上旋转5分钟。
4. 将顶相置于新管中，用700μl氯仿提取，在室温下剧烈涡旋20秒。＆nbsp;
5. 如上旋转1分钟。
6. 将顶相置于新管中，用600μl氯仿提取，在室温下剧烈涡旋20秒。＆nbsp;
7. 如上旋转1分钟。
8. 将500μl顶相置于新管中，加入50μl3MNaOAc和冰冷的1.4ml 96％乙醇沉淀RNA。
9. 在4°C下全速旋转20分钟。
10. 用1ml 70％乙醇洗涤沉淀两次。
11. 每管重悬100μlRNA储存液中的RNA。
  注意：小心避免过度干燥颗粒，因为非常干燥的颗粒很难溶解。这可以通过首先用移液管移除大部分乙醇，短暂地重新旋转，用移液管P200移除任何剩余的乙醇然后将管打开约1小时来完成。在重新悬浮之前在室温下打开1分钟。重悬应该很快，只需要稍微摇晃和/或上下移液。
12. 合并来自3个等分试样的RNA，并使用即，Nanodrop测量1：5稀释的RNA浓度。
  注意：未稀释样品的RNA浓度应> 1μg/μl。
生物素化4sU RNA
1. 通过用4μl1M HEPES-KOH pH 7.5和0.8μl0.5M EDTA缓冲500μgRNA来制备偶联反应，并用RNA储存溶液填充至400μl。
  注意：如果没有500μgRNA，则协议可以使用300μg甚至更低。＆nbsp;
2. 可选：添加加标RNA。我们通常使用3-5μg（1/100 w / w） S. pombe 加标RNA（参见配方和数据分析）。
3. 加入10μl5mg/ ml MTSEA-生物素原液，涡旋混合并在黑暗中于25℃孵育30分钟。
4. 在此孵化期间准备Zeba柱，将Zeba柱置于15ml Falcon管中。每个柱子用2ml RNA储存溶液排出并洗涤3次。对于每次洗涤：施加液体并在1,000 x g 下旋转2分钟。
5. 将MTSEA偶联反应应用于排出的Zeba柱，让液体在树脂中浸泡2分钟，然后加入另外130μlRNA储存溶液，在新鲜的15 ml Falcon中以1,000 xg 旋转2分钟并回收流过物，其中含有生物素偶联的RNA，不含游离的MTSEA-生物素偶联试剂。用50μl3MNaOAc和1.4ml 96％乙醇沉淀流过液（约500μl）。在4°C孵育30分钟或在-20°C孵育过夜。在4°C下全速旋转20分钟。
6. 在室温下洗涤2次，每次1小时，在黑暗中用1ml 80％乙醇洗涤。在4℃下旋转15分钟，在洗涤之间旋转16,000 x g 注意：如上所述，注意不要使颗粒过度干燥，即，只需将颗粒在室温下打开管子1分钟，然后重新悬浮。
7. 在250μlRNA储存溶液中重悬RNA。
8. 取10μl输入（'总RNA'）等分试样。
分离生物素化的RNA
1. 加入240μlRNA样品：30μl10xNaMg，30μl1MNaPi，3μl10％SDS。
  注意：这导致RNA样品在~300μl，溶剂组成相当于1x NaPSMg。
2. 准备磁性链霉抗生物素蛋白偶联珠（根据样品数量调整量）：
  1. 每个样品使用50μlDynabeadsMyOne链霉抗生物素蛋白C1浆液。
  2. 通过在磁铁上施加并移除液体来排出珠子。
  3. 先用400μl1xNaMgPS洗涤1次。
  4. 用200μl1xNaMgPS + 10μl20mg/ ml糖原阻断珠子。
  5. 在室温下旋转20分钟。
  6. 从磁珠中去除阻塞溶液。
  7. 用400μlNaMgPS洗涤1次。
3. 沥干珠子并立即添加RNA。
4. 让RNA在室温下通过在黑暗中的旋转轮上轻轻搅动（即）与珠子结合30分钟。
5. 从磁珠中去除上清液。
6. 每次用400μl1xNaMgPS洗涤5次。
7. 用400μlTEN1000洗涤1次。
8. 通过用50μlβ-巯基乙醇孵育2x来洗脱生物素化的RNA。在室温下孵育5分钟，然后在每个步骤中除去洗脱液。
9. 将洗脱液和沉淀RNA与10μl3MNaOAc，pH5,2.5μl20mg/ ml糖原和250μl96％乙醇混合。
10. 在干冰上孵育30分钟或-20°C过夜。
11. 全速旋转30分钟，4°C。
12. 用75％乙醇洗涤RNA沉淀2次，尽可能地除去β-巯基乙醇。
13. 重悬于20μlRNA储存溶液中。
14. 根据制造商的说明，使用来自Ambion的TURBO DNase试剂盒，DNase-处理2μl（4μg）总RNA等分试样和17.6μl（300ng）4tU IP样品。＆nbsp;
15. 可选：使用Bioanalyzer和RNA pico试剂盒（Agilent），Qubit或类似物检测RNA质量和浓度（参见图1）。＆nbsp;
16. 可选：使用2μl洗脱RNA进行质量控制（参见 [可选]质量控制部分）。
用E-PAP进行体外多聚腺苷酸化
1. 向5μl经DNase处理的RNA中加入4μl5xE-PAP缓冲液，2μl25mM MnCl 2 ，0.2μlE-PAP（2 U /μl）来自 Escherichia coli poly（A）聚合酶试剂盒（Thermo Fisher），2μl10mMATP，0.2μlRiboLock和6.6μl无RNase的ddH 2 O.
2. 混合并在30℃下孵育30分钟。
3. 根据制造商的说明，使用PureLink RNA纯化试剂盒micro（Ambion）从多聚腺苷酸化反应中纯化RNA，并在22μl无RNase的ddH 2 O中洗脱。
Ribo-depletion
注意：以下协议基于Illumina的RiboGold套件，该套件已不再商业化。它也适用于其他类似产品（例如RNA-seq试剂盒）。
1. 使用用于酵母（Illumina）的Ribo-Zero Gold rRNA去除试剂盒进行核糖耗竭，基本上按照制造商的说明，但使用缩小版本。
2. 将18μl洗脱液与2μl反应缓冲液，2μl去除溶液和8μl无RNase的ddH 2 O混合。＆nbsp;
3. 在65°C孵育10分钟并冷却至室温5分钟。
4. 向步骤F3的反应混合物中加入65μlrRNA磁珠，首先在室温下孵育5分钟，然后在50℃下孵育5分钟。将未结合的溶液转移至含有40μlddH 2 O和10μl3MNaOAc和20μg糖原的新管中。
5. 加入300μl乙醇，在-20°C下沉淀RNA 20分钟，并在4°C下旋转30分钟。
6. 用70％乙醇洗涤沉淀两次。
7. 将沉淀重悬于10μlRNA储存溶液中。
3'末端RNA-seq文库制备和测序
1. 使用5μlIP或1μl输入等分试样作为起始RNA材料，并根据制造商的说明使用QuantSeq REV试剂盒（Lexogen）制备RNA-seq文库。＆nbsp;
2. 使用单读取50 nt读数或具有QuantSeq REV规范定义的定制引物的类似机器对Illumina HiSeq上的序列样品进行测序。目标是每个库大约有500万个主读取，以实现 S的必要深度。 cerevisiae 实验。
  
  图1.最终测序文库的生物分析仪痕迹示例。显示的文库来自未经E-PAP处理的样品。泳道1-4来自总RNA，泳道5-11来自10'4tU IP样品。所有样品均成功用于Illumina测序。
  
  （可选）4tU标记RNA的质量控制
  1. 使用2μl输入和洗脱样品。＆nbsp;
  2. 根据制造商的说明，使用Superscript II或等效物和Oligo（dT） 18 进行逆转录。
  3. 根据制造商的说明，在100μl无核酸酶水中稀释RT反应，如果每16μlqPCRPlatinum SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG试剂盒反应稀释RT，则使用2μl。用1:10稀释的RT制备针对mRNA和RNAPIII非腺苷酸化转录物SCR1的寡核苷酸的反应。＆nbsp;

数据分析

使用公式RNA conc = 2 （ - Ct），从RT-qPCR值估计各种靶标的RNA浓度当量;任选地包括用于校正的因子和测量的引物效率。然后将这些值相对于针对 S的峰值估计反应获得的值进行归一化。 pombe ACT1 mRNA。使用外部尖峰进行归一化可以直接比较样品和标签时间的IP效率，并可以消除由于其复杂性质而可能产生的技术噪声（即，IP效率）。实验。来自阴性对照洗脱液的标准化值（即，来自没有4tU的样品）用于估计洗脱样品中的背景。应该在背景之上显着富集几种mRNA，这表明该实验已经起作用。注意，目标是为新生（即，pA - ）4tU标记的RNA强烈富集，这是通过短标记时间实现的。成熟RNA（pA + mRNA，全长snRNA）的富集在标记时间增加时最有效（参见图2）。也就是说，对于标记10分钟，绝大多数（> 90％）转录物显着高于背景。对于2分钟标记，pA + RNA在背景之上的富集不太显着，并且在技术重复之间显着高于背景的检测到的转录物的数量显着不同。通常，发现至少约20％的所有转录物显着富集。因此，我们通常使用2分钟标记时间来富集新生RNA（其中许多但不是所有成熟RNA也在背景上显着富集），并且仅在测量全长RNA时标记时间为10分钟。
＆NBSP;为了控制体外多聚腺苷酸化反应（E-PAP处理），比较非腺苷酸化的 SCR1 相对于mRNA的比例。相对于E-PAP处理的样品中的mRNA，这些物种应富集至少10倍。

图2.标记2和10分钟后的RNA回收率和E-PAP处理效率。 A. 4tU标记时间的标记效率提高。野生型细胞分别用4tU处理0,2和10分钟。该图描绘了来自模拟，2'4tU和10'4tU标记时间（SpACT1， S.pombe ACT1 ）的IP效率（描述为％输入）和 S上。 cerevisiae mRNAs PMA1 和 HHF1 ，以及端粒酶RNA TLC1 的多腺苷酸化前体。 B.用E-PAP处理之前和之后的总RNA的RT-qPCR。用Oligo（dT） 18 逆转录RNA，并通过qPCR用 SCR1 （非多腺苷酸化RNAPIII产物）和PMA1（多腺苷酸化mRNA）的引物定量。然后检测非多腺苷酸化的 SCR1 RNA。 E-PAP处理后效率提高1,000倍，而 PMA1 信号不受影响。

食谱

URA - 培养基（不含尿嘧啶的合成生长培养基）
不含尿嘧啶的0.2％（w / v）SC氨基酸混合物
2％（w / v）葡萄糖
0.67g（w / v）酵母氮碱
溶于ddH 2 O，高压灭菌并在室温下储存
4tU库存
在DMSO中的100mM 4-硫尿嘧啶，储存在-20℃。使用前温热至室温
TES
10mM Tris-HCl，pH 7.5
1mM EDTA，1％（w / v）SDS
从无RNase的库存中准备并保持在室温
S上。 pombe spike-in RNA
1. 增长标准 S. pombe 细胞在30°C下在YPAD生长培养基中指数生长，并用5 mM（w / v）最终4tU标记15分钟
2. 按照 S所述制备总RNA。上述酿酒酵母并将等分试样储存在-20℃的RNA储存溶液中
RNA储存解决方案
1 mM柠檬酸钠，pH 6.4
从无RNase的库存中准备并保持在室温
3 M NaOAc
用乙酸将3M醋酸钠调节至pH至5
从无RNase的库存中准备并保持在室温
MTSEA-生物素库存
DMF中5 mg / ml
储存在-20°C
1 M HEPES-KOH，pH 7.5
用KOH将1M HEPES调节至pH 7.5
从无RNase的库存中准备并保持在室温
0.5 M EDTA-NaOH
用NaOH将0.5M EDTA调节至pH8 从无RNase的库存中准备并保持在室温
1 M NaPi缓冲液，pH 6.8
将1 M Na 2 HPO 4 与1M NaH 2 PO 4 混合，达到pH 6.8
从无RNase的库存中准备并保持在室温
10x NaMg
100mM Tris-HCl，pH 7.0
2 M NaCl
250mM MgCl 2
从无RNase的库存中准备并保持在室温
1x NaMgPS
1x NaMg（从10x开始1:10）
100mM NaPi（从1M的1:10）
0.1％SDS（1：100，10％）
在使用无RNase的H 2 O之前准备新鲜并保持在室温下
注意：可形成沉淀物，可通过温和加热重新溶解。
TEN1000
10 mM Tris，pH 7.5
0.5 mM EDTA
1 M NaCl
从无RNase的库存中准备并保持在室温
0.7Mβ-巯基乙醇
在RNA储存溶液中1:20稀释纯β-巯基乙醇。准备新鲜
20 mg / ml糖原
准备无RNase的H 2 O并保持在-20°C

致谢

我们感谢David Barrass和Jean Beggs最初的4tU标签和IP协议以及Rikke Jespersen和DortheCarolineRiishøj的技术支持。在T.H.J.工作实验室得到丹麦国家研究委员会，伦德贝克基金会（R171-2014-553）和ERC（授权339953）的支持。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

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