材料和试剂

注意：如果没有另外说明，所有试剂均购自Thermo Fisher，并在室温下储存。

移液器吸头
塑料薄膜
注射器
凝胶垫片0.8毫米（Cole-Parmer，UX-28573-12）
杂交管2 x 200 mm（VWR，目录号：32645-030）
Whatman论文（Whatman TM ，10427812等级）
Hybond-XL膜（GE Healthcare，目录号：45-001-148）＆nbsp;
5' 32 P标记的寡核苷酸探针（参见程序B）
[γ- 32 P] ATP（PerkinElmer，目录号：NEG035C005MC）（贮存：-20°C）
T4多核苷酸激酶（10 U /μl）（Thermo Fisher，目录号：EK0032）（贮存：-20°C）
1x T4 PNK缓冲区
3-丙烯酰胺基苯硼酸（Frontier Scientific，目录号：A10094-5g）（贮存：4°C）
40％丙烯酰胺/双溶液，29：1（Bio-Rad，目录号：161-0146）＆nbsp;
醋酸＆nbsp;
DMEM（Thermo Fisher，目录号：11965092）
EDTA＆NBSP;
乙醇，95.5％USP（Ricca，目录号：R2916000-1A）＆nbsp;
胎牛血清透析（Thermo Fisher，目录号：26400044）
Queuine Hydrochloride（多伦多研究化学品，目录号：Q525000）
醋酸钠＆nbsp;
氯化钠（NaCl）＆nbsp;
十二烷基硫酸钠（SDS）＆nbsp;
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）（Thermo Fisher，目录号：BP329）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Thermo Fisher，目录号：S374）
10x TAE缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：11666690001）
Tris（Bioland Scientific，目录号：CT01-5kg）
尿素＆NBSP;
溴酚蓝
二甲苯蓝
10x TBE缓冲液（EMD Millipore，目录号：8850-OP）
醋酸钠（KOAc）
氯化钠（KCl）
不含核酸酶的水
2x凝胶加载缓冲液（见食谱）
10％变性聚丙烯酰胺凝胶（见食谱）
10％APB聚丙烯酰胺凝胶（见食谱）
透析血清培养基（见食谱）
凝胶提取缓冲液（见食谱）
杂交缓冲液（见食谱）
1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.0）（见食谱）
1 M Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）（见食谱）
洗涤液（见食谱）

设备

移液器
微量离心机（Eppendorf，型号：5415D）
杂交烤箱（UVP，型号：95-0030-01）
Phosphoimager（Bio-Rad，Molecular Imager Pharosfx Plus System，170-9460）＆nbsp;
荧光屏（Bio-Rad或Fuji）＆nbsp;
X射线盒式磁带K 35 x 43 cm（Bio-Rad）
玻璃板17 x 15 cm的聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（Biometra，型号V16-2）
Thermoblock 24 x 1.5 ml（Eppendorf，022670522）
管旋转器（Cole-Parmer Ltd，型号：SB3）
真空凝胶干燥器（Bio-Rad，Model 583 Gel Dryers）
孵化器＆NBSP;
4°C冰箱
-20°C冰柜

软件

数量一（Bio-Rad Laboratories，Inc.， www.bio-rad.com/ ）

程序

人体细胞培养＆nbsp;
1. 获得Q-剥夺（0Q）人类细胞
  在透析的血清培养基中培养细胞至少5次。在每次加倍后，Q-修饰水平预计会降低2倍。
2. 产生完全Q-修饰的（100Q）人类细胞
  将细菌盐酸盐溶液加入细胞培养基中，终浓度为0.1-1μM，孵育至少12小时。
  注意：此处提供的条件已针对HEK293T细胞进行了验证，这些细胞需要针对每种细胞系单独进行优化。
3. RNA提取（如下所述）
32 P-标记和纯化Northern探针
在进行Northern印迹分析之前，制备与感兴趣的tRNA种类互补的5' 32 P标记的寡核苷酸探针。如果需要，为未用Q（例如，tRNA Ala ）修饰的tRNA制备探针作为阴性对照。
警告：[γ - 32 P] ATP具有高放射性。遵守处理放射性物质所需的所有安全程序（例如，订购，储存，个人防护，屏蔽，防止和检测污染等）。请联系相应的实验室/部门安全检查员以获取更多信息，以及有关可用培训的信息。
人tRNA的寡核苷酸探针序列是：
（tRNA的他）5'TGCCGTGACTCGGATTCGAACCGAGGTTGCTGCGGCCACAACGCAGAGTACTAACCACTATACGATCACGGC;
（tRNA的的Asn ）5'CGTCCCTGGGTGGGCTCGAACCACCAACCTTTCGGTTAACAGCCGAACGCGCTAACCGATTGCGCCACAGAGAC;
寡核苷酸可以从DNA合成公司订购（例如，IDT，凝胶纯化就足够了）。
1. 通过T4 PNK反应用[γ- 32 P] ATP标记寡核苷酸
  1. 使用20pmol的每种寡核苷酸进行标记。
  2. 使用来自供应商的1x T4 PNK缓冲液，6 U /μlT4PNK，28μCi/μl[γ- 32 P] ATP设置反应，并加水至终体积10μl。
  3. 在37℃下在热块中孵育30分钟。
  4. 通过添加2x凝胶上样缓冲液灭活T4 PNK。
2. 探针的凝胶纯化
  1. 将样品装载在10％变性聚丙烯酰胺凝胶上。
  2. 在18 W运行凝胶，直到第一个染料BPB位于凝胶底部（通常约1小时）。＆nbsp;
  3. 将凝胶暴露于磷光成像仪屏幕1分钟（此时间可根据探针的放射性而变化）。＆nbsp;
  4. 根据信号，切除与探头对应的频段。＆nbsp;
  5. 用凝胶提取缓冲液孵育压碎的凝胶切片，并在管旋转器上将混合物在4℃下旋转过夜。＆nbsp;
3. 探针的沉淀
  1. 以最大速度离心样品30分钟，从上面的凝胶切片中收集溶液。＆nbsp;
  2. 使用3倍体积的100％乙醇在-20°C下沉淀DNA 2小时。＆nbsp;
  3. 以最大速度离心样品30分钟并除去上清液。
  4. 用70％乙醇洗涤沉淀。＆nbsp;
  5. 以最大速度离心样品5分钟并除去上清液。
  6. 将沉淀重悬于400μl不含核酸酶的水中。每个印迹使用1/4的制备探针（如下所述）。
    注意：理想情况下，荧光探针可用于代替 32 P标记的探针。但是，我们自己还没有优化荧光探针的使用。此时荧光探针的灵敏度可能比 32 P探针低很多，因此可能需要更多RNA样本。
APB凝胶分离总RNA
1. 总RNA提取
  1. 从哺乳动物细胞中提取总RNA（例如，Trizol方法，参见参考文献6）
    注意：如果使用RNA提取试剂盒，请选择不会丢失小RNA的试剂盒。
  2. 测量样品的RNA浓度。
  3. 对每个分析的样品等分5μg或更多RNA。如果不可用，可以使用低至1μg的总RNA。保持RNA样品的总体积低，因此在加入2x凝胶上样缓冲液（最终体积：约20μl，步骤B2c）后，整个样品可以适合一个泳道。
2. RNA的去酰基化去除附着在tRNA的3'末端的氨基酸
  1. 将RNA与100mM终浓度的Tris-HCl（pH9.0）混合。
  2. 在37℃下在热块中孵育30分钟。＆nbsp;
  3. 将脱酰化的RNA样品与等体积的变性2x凝胶上样缓冲液组合。（如果需要，将样品保存在-20°C以备将来使用）＆nbsp;
3. APB凝胶
  1. 准备含有5％3-丙烯酰胺基苯硼酸的10％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶（调整凝胶溶液的体积到实验室可用的玻璃板和凝胶垫片）。＆nbsp;
  2. 将凝胶在1x TAE缓冲液中预运行30分钟（例如，使用设备中列出的电泳装置在恒定的18 W下）。＆nbsp;
  3. 使用注射器和1x TAE缓冲液清洗凝胶孔。＆nbsp;
  4. 将样品装到凝胶上。＆nbsp;
  5. 在1x TAE缓冲液中以18 W进行凝胶电泳，直至第一染料（BPB）到达凝胶底部。＆nbsp;
北方的污点

凝胶转移
1. 电泳后，取下玻璃板。
2. 将Hybond-XL膜放在凝胶上（标记凝胶的方向）。
3. 将凝胶从玻璃板上取下并制作如下（从底部）的“三明治”：Whatman滤纸 - 膜 - 凝胶 - 塑料箔。＆nbsp;
4. 使用真空凝胶干燥器在80℃下将RNA转移到膜上2小时。
预杂交
1. 使用蒸馏水从凝胶中取出膜。
2. 在室温下在杂交缓冲液中将膜洗涤两次，每次30分钟。＆nbsp;
杂交
1. 将膜放入适当大小的杂交管中（根据膜的大小调整）。＆nbsp;
2. 每管加15ml杂交缓冲液。＆nbsp;
3. 加入100μl预先制备的5' 32 P-标记的寡核苷酸探针（在方法A中描述）。
4. 将管在杂交炉中孵育并旋转16小时，温度为60°。＆nbsp;
洗膜＆nbsp;
1. 删除杂交缓冲区。
2. 在60°C的洗涤溶液中将膜洗涤两次，每次30分钟。＆nbsp;
3. 将膜从管中取出并干燥，直至看不到洗涤液中的气泡。＆nbsp;
膜暴露
将膜放入盒中，用塑料薄膜覆盖，并在6至16小时内暴露于荧光屏。
读信号
使用phosphoimager扫描并使用Imager软件量化检测到的条带的强度。结果的一个例子如图2所示。

图2. Q-修饰动力学 tRNA Asn 的Q修饰的时间过程，从添加1μMcouine到0Q细胞培养基开始（每个加载5μg总RNA）泳道）。

数据分析

使用Quantity One成像仪软件分析扫描的凝胶图像。
如果程序正确执行，最终图像应显示对应于预期tRNA种类的Q-修饰和/或含G部分的单独条带（图2）。如果需要更大的分离，运行凝胶更长时间，同时防止使用染料迁移作为指导运行tRNA，或使用更长的凝胶。在进行转移步骤时，确保切下含有目标tRNA分子的凝胶部分。
＆NBSP;在量化结果时，假设一条泳道中的所有信号（Q-tRNA + G-tRNA）代表在该泳道中加载的该物种的总tRNA。计算每个样品的Q-修饰的tRNA的分数为[Q-带] /（[Q-带] + [G-带]）。
＆NBSP;对于阴性对照，使用针对未经Q修饰的tRNA（例如，tRNA Ala ）的探针重复相同的程序，其应仅在APB凝胶上显示一个条带。
＆NBSP;另一个对照是首先进行RNA样品的过氧化物氧化，其破坏顺式 - 二醇。 Q碱基和RNA的3'末端，因此探测的tRNA种类比G-带运行得更快（Igloi和Kossel，1985; Zaborske 等人，2014）。

食谱

所有指定的浓度是每种化学品的最终浓度。

2x凝胶上样缓冲区
9 M尿素
100 mM EDTA
0.2％（w / v）溴酚蓝
0.2％（w / v）二甲苯蓝
10％变性聚丙烯酰胺凝胶
10％丙烯酰胺/双溶液，29：1
9 M尿素
1x TBE
10％APB聚丙烯酰胺凝胶
10％丙烯酰胺/双溶液，29：1
9 M尿素
1x TAE
5％3-丙烯酰胺基苯硼酸
透析血清培养基（HEK293T和HeLa）
DMEM
10％透析的FBS
凝胶提取缓冲液
50mM KOAc，pH 7.0
200mM KCl
杂交缓冲区
20 mM磷酸钠，pH 7.0
300 mM NaCl
1％十二烷基硫酸钠（SDS）
1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.0）
390mM NaH 2 PO 4
610mM Na 2 HPO 4
1 M Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）
1 M Tris
用HCl调节pH
洗涤液
20 mM磷酸钠，pH 7.0
300 mM NaCl
0.1％SDS
2 mM EDTA

致谢

该方法基于先前开发的方案（Zaborske et al。，2014; Wang et al。，2018）。我们感谢DoD / CDMRP（BC160450到T.P.）的支持。

利益争夺

没有利益冲突或竞争利益。

参考

El Yacoubi，B.，Bailly，M。和de Crecy-Lagard，V。（2012）。转录RNA转录后修饰的生物合成和功能。 Annu Rev Genet 46：69-95。＆nbsp;
Fergus，C.，Barnes，D.，Alqasem，M。A.和Kelly，V。P.（2015）。野生微量营养素：绘制从微生物到人类的过程。营养素 7（4）：2897-2929。＆nbsp;
Igloi，G。L.和Kossel，H。（1985）。亲和电泳用于监测末端磷酸化和RNA中存在的queuosine。含有共价结合硼酸的聚丙烯酰胺的应用。 Nucleic Acids Res 13（19）：6881-6898。＆nbsp;
Rakovich，T.，Boland，C.，Bernstein，I.，Chikwana，V。M.，Iwata-Reuyl，D。和Kelly，V。P.（2011）。真核生物中的Queuosine缺乏会通过增加四氢生物蝶呤氧化而损害酪氨酸的产生。 J Biol Chem 286（22）：19354-19363。＆nbsp;
Singhal，R.P.，Kopper，R.A.，Nishimura，S。和Shindo-Okada，N。（1981）。在发育和衰老过程中修饰转移RNA中鸟嘌呤对鸟类的作用。 Biochem Biophys Res Commun 99（1）：120-126。＆nbsp;
TRIzolTM试剂RNA提取方案： https://assets.thermofisher.com/TFS -Assets / LSG /说明书/ trizol_reagent.pdf。
Tuorto，F.，Legrand，C.，Cirzi，C.，Federico，G.，Liebers，R.，Muller，M.，Ehrenhofer-Murray，AE，Dittmar，G.，Grone，HJ和Lyko，F。（ 2018）。 Queuosine-modified tRNAs赋予蛋白质翻译的营养控制。 EMBO J 37（18）pii：e99777。
Wang，X.，Matuszek，Z.，Huang，Y.，Parisien，M.，Dai，Q.，Clark，W.，Schwartz，M。H. and Pan，T。（2018）。 Queuosine修饰保护同源tRNA免受核糖核酸酶切割。 RNA 24（10）：1305-1313。＆nbsp;
Zaborske，J.M.，DuMont，V.L.，Wallace，E.W。，Pan，T.，Aquadro，C.F。和Drummond，D.A。（2014）。营养驱动的tRNA修饰可改变动物属的翻译保真度和全基因组蛋白编码。< / a> PLoS Biol 12（12）：e1002015。