材料和试剂

材料
1. 6厘米无菌培养培养皿（Fisher，目录号：AS-4052）
2. 10厘米无菌培养培养皿（Corning，目录号：430167）
3. 15厘米无菌培养培养皿（Corning，目录号：430599）
4. 10毫升无菌注射器（BD，目录号：309604）
5. PES0.22μm孔无菌注射器过滤器（Millipore，目录号：SLGP033RS）
6. 无菌0.22μm瓶顶过滤器（Fisher，目录号：09-761-112）
7. 介质存储瓶，500毫升，1,000毫升（Fisher，目录号：06-414-1C，06-414-1D）
8. Hydrion pH纸（Fisher，目录号：14-853-150N）
9. 15毫升Falcon锥形管（Fisher，目录号：14-959-70C）
10. 50毫升Falcon锥形管（Fisher，目录号：14-959-49A）
11. 40μm无菌细胞过滤器（Fisher，目录号：22363547）
动物
E18怀孕雌性Sprague-Dawley大鼠
原发性神经元解剖
1. 硫酸钠（Na 2 SO 4 ）（Sigma，目录号：S5640-500G）
2. 硫酸钾（K 2 SO 4 ）（Sigma，目录号：P8541-1KG）
3. 氯化镁（MgCl 2 ），1M溶液（Sigma，目录号：M1028-100ML）
4. 无水氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma，目录号：C5670-500G）
5. HEPES，1 M解决方案（Gibco，目录号：15630-080）
6. 葡萄糖（Gibco，目录号：15023-021）
7. 酚红（Sigma，目录号：P0290-100ML）
8. 氢氧化钠（NaOH），10 N（Ricca Chemical，目录号：7470-32）
9. 细胞培养级无菌水（Hyclone，目录号：SH30529.03）
10. 汉克斯平衡盐溶液（HBSS），10倍（西格玛，目录号：H1641-500ML）
11. 碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Sigma，目录号：S5761-500G）
12. L-半胱氨酸盐酸盐一水合物（半胱氨酸-HCl）（Sigma，目录号：C7880-100G）
13. 木瓜蛋白酶（Worthington Biochemical Corp，目录号：LS003126）
14. 细胞培养级无菌水（Hyclone，目录号：SH30529.03）
15. 牛血清白蛋白（BSA），级分V（Fisher，目录号：BP1600-100）
16. 大豆胰蛋白酶抑制剂（Sigma，目录号：T6522-1G）
17. 磷酸盐缓冲盐水（PBS），10x溶液（Fisher，目录号：SH3037803）
18. 1x PBS溶液（使用细胞培养级无菌水从10x PBS稀释）
19. 多聚甲醛（PFA）（Fisher，目录号：AC416780030）
20. HBSS解剖培养基（4°C储存长达3个月）（见食谱）
21. 解离介质（在4°C下储存长达3个月）（见食谱）
22. L-半胱氨酸50x库存（见食谱）
23. 木瓜蛋白酶解离溶液和抑制剂解决方案用于分离原代大鼠皮层神经元（使用当天新鲜）（见食谱）
  1. 酶解决方案
  2. 重抑制剂解决方案
  3. 光抑制剂溶液
24. 4％PFA溶液（见食谱）
电镀和培养基
1. Neurobasal Media（Gibco，目录号：21103-049）
2. 胎牛血清，热灭活（Hyclone，目录号：SH30070.03HI）
3. B27 Media Supplement，50x（Gibco，目录号：17504-044）
4. Glutamax（Gibco，目录号：35050-061）
5. 青霉素/链霉素抗生素溶液（Gibco，目录号：15140-122）
6. 用于播种的皮质神经元培养基（在4°C下储存最多10天）（参见食谱）
7. 用于喂养的皮质神经元培养基（在4°C下储存最多10天）（参见食谱）
微流体装置的制备，培养和再利用
1. Xona Microfluidics ®微通道培养微流体装置
  1. 450μm微槽屏障标准神经元设备（Xona Microfluidics，目录号：SND450）
  2. 900μm微槽屏障标准神经元装置（Xona Microfluidics，目录号：SND900）
2. 康宁盖玻片盖玻片（康宁，目录号：2975-244）
3. 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐，MW 70,000-150,000（Sigma，目录号：P0899-50MG）
4. 硼酸（Fisher，目录号：S79802）
5. Borax，无水（MP Biomedicals，目录号：190309）
6. HCl，12 N（Fisher，目录号：A144-500）
7. 细胞培养级无菌水（Hyclone，目录号：SH30529.03）
8. RBS清洁剂溶液（Thermo，目录号：27950）
9. 100％乙醇（Decon Labs，目录号：2705HC）
10. 0.1 M硼酸盐缓冲溶液（见食谱）
11. Poly-D-Lysine 2.5 mg / ml储备液（见食谱）
12. Poly-D-Lysine100μg/ ml涂层溶液（参见配方）
鱼藤酮治疗
1. DMSO（Sigma，目录号：D2438）
2. Rotenone（Sigma，目录号：R8875-1G）
3. Rotenone股票解决方案（见食谱）
4. Rotenone 2x和1x解决方案（参见食谱）
5. DMSO车辆控制2x和1x解决方案（参见食谱）

设备

CO 2 坦克＆nbsp;
CO 2 单级流量计调节器（Western Medica，型号：M1-320-12FM）
CO 2 气体麻醉箱（Braintree Scientific，型号：AB-2）
Motic Dissection显微镜（Motic，型号：SMZ-168）
Roboz手术器械解剖工具＆nbsp;
1. Dumont＃5镊子，直尖（Roboz，目录号：RS-5060）
2. 杜蒙＃5镊子，45度尖（Roboz，目录号：RS-5005）
3. Straight，Sharp-Blunt操作剪刀（Roboz，目录号：RS-6812）
4. 超细微解剖剪刀（Roboz，目录号：RS-5882）
5. Micro Dissecting Spring Scissors（Roboz，产品目录号：RS-5603）
Sorvall Legend T台式离心机（Thermo，型号：75004367）
Nuaire Class II A2型层流无菌培养罩，带真空垃圾系统（Nuaire，型号：NU-425-400）
徕卡Fiberlight光源（徕卡，型号：EEG2823）
奥林巴斯光学显微镜（奥林巴斯，型号：CKX31）
HeraCell CO 2 - 和温控培养箱（Thermo，型号：51022394）
Isotemp 110加热水浴（Fisher Scientific，型号：15-460-10）
Wheaton玻璃载玻片染色罐（Fisher Scientific，型号：22-309-247）
一次性转移移液器（Fisher Scientific，目录号：13-711-20）
Rocking Shaker Plate（Labnet，型号：S-2035）
加热搅拌板（康宁，型号：PC-420）
Accumet碱性pH计（Fisher Scientific）
涡旋混合器（Labnet，型号：VX100）
规模（丹佛仪器，型号：APX-100）
Millipore Milli-Q超纯水系统
各种机械移液器和相应的无菌吸头
血细胞计数器和细胞计数器
温度计
高压灭菌器
化学通风柜
4°C冰箱
-20°C冰柜
-80°C冰柜

程序

提前准备解剖和电镀
1. 根据下面的食谱准备硼酸盐缓冲溶液，解离介质和HBSS解剖介质。
2. 根据以下食谱准备必要数量的播种培养基和饲喂培养基。准备的数量取决于计划实验的规模。
  1. 每个完整的神经元制剂需要大约25毫升的种子培养基，每个装置需要大约5毫升的喂养培养基用于电镀和维护。
  2. 制备的培养基可以保存长达10天，并可用于随后的神经元制备。因此，为后续使用制作足够的媒体是合理的。＆nbsp;
在解剖和电镀前准备2天
1. 解冻Poly-D-Lysine
  1. 从-80℃下取必要数量的2.5mg / ml聚-D-赖氨酸储备溶液（400μl）的等分试样。
  2. 置于冰上，在4°C下解冻过夜。
2. 酸洗和消毒盖玻片
  1. 在无菌培养罩中，将所需数量的盖玻片（每个待镀设备1个，加上2个额外的）放入载玻片染色罐中。
  2. 加入50毫升1N HCl（在无菌细胞培养水中制备）。＆nbsp;
  3. 将盖子放在染色罐上，然后将罐子放在罩子外面的振动筛板上。在振动筛板上轻轻搅拌盖玻片1小时。
  4. 将罐子放回无菌培养罩中，通过移液管或抽吸从罐中取出HCl。
  5. 将无菌细胞培养水加入罐中，盖上盖子，然后将罐子放在罩子外面的振动筛板上。重复此水冲洗3 x 10分钟。
  6. 通过移液管或抽吸除去最后的水洗液，并加入50ml 70％乙醇溶液以对盖玻片进行灭菌。盖上广口瓶，在振动筛板上轻轻搅拌30分钟。
  7. 通过移液管或抽吸除去乙醇洗液，并向盖玻片中加入50ml无菌培养水。盖上广口瓶，在振动筛板上轻轻搅拌10分钟。
  8. 在无菌培养罩中，从染色罐中取出盖玻片，并在敞开的10cm培养皿中静置以风干。将盖玻片的边缘向上推到培养皿的侧面 - 不要让盖玻片平放。
  9. 干燥后，将盖玻片暴露在无菌培养罩的紫外线（UV）下20分钟，对盖玻片进行灭菌。
  10. 紫外线照射后，将盖玻片放入培养皿内并盖上盖子。在密闭容器中或在无紫外线照射的无菌培养罩中储存过夜。
在解剖和电镀前准备1天
1. 涂有Poly-D-Lysine的盖玻片
  1. 在无菌培养罩中进行该程序。
  2. 安排盖玻片，使它们平放，不重叠，放在10厘米培养皿的底部。
  3. 通过将2.5mg / ml聚-D-赖氨酸储备溶液以400μl，2.5mg / ml的比例添加到无菌0.1M硼酸盐缓冲液中，每10cm培养皿制备6ml100μg/ ml聚-D-赖氨酸涂层溶液。聚-D-赖氨酸原液至9.6毫升，0.1M硼酸盐缓冲液。
  4. 混合并无菌过滤100μg/ ml聚-D-赖氨酸涂层溶液。
  5. 用100μg/ ml聚-D-赖氨酸涂层溶液覆盖盖玻片，将盖子放在培养皿上，让溶液在4°C下盖上盖玻片过夜。
2. 消毒微流体装置
  1. 在无菌培养罩中工作，从包装中取出设备。
  2. 将装置槽侧向上（即，倒置）放入无菌的10cm培养皿中。
  3. 将设备浸入100％乙醇中30分钟。
  4. 除去乙醇，将设备浸入70％乙醇中30分钟。
  5. 从乙醇中取出装置，并浸入一盘无菌细胞培养水中。
  6. 在无菌培养皿的边缘上以一定角度设置装置，并允许在无菌培养罩中完全干燥。
  7. 放在培养皿中并盖上盖子。在密闭容器中或在无菌培养罩中在黑暗中储存过夜，无需紫外线或荧光灯照射。
  8. 不要随时将设备暴露在紫外线下。
解剖日
1. 根据下面的食谱准备木瓜蛋白酶溶液和抑制剂溶液。
2. 将饲喂培养基，种子培养基，木瓜蛋白酶消化液和木瓜蛋白酶抑制剂溶液置于37°C水浴中。
3. 将HBSS解剖溶液置于冰上。将约150ml HBSS等分至待用于工作台，并将25ml HBSS保持无菌以用于罩中。
4. 冲洗干燥盖玻片
  1. 在无菌培养罩中工作，使用无菌镊子从聚-D-赖氨酸溶液中取出盖玻片，并将角度放置在无菌培养皿的边缘上以使其干燥。
  2. 干燥后，将每个盖玻片3 x浸入无菌培养水中冲洗，让水在蘸水之间滴落。
  3. 将盖玻片浸入无菌1x PBS中，让溶液滴下，然后返回培养皿，支撑在培养皿边缘，使其完全干燥。不要暴露在紫外线下。
5. 将微流体设备连接到盖玻片上并使用喂养介质进行灌注 - 参见图1，了解设备的放置和方向
  1. 在无菌培养罩中进行该程序。
  2. 使用无菌镊子，将单个Poly-D-Lysine涂层的盖玻片放在无菌的6 cm培养皿的底部，确保将Poly-D-Lysine涂层面朝上。
  3. 使用第二组无菌镊子，提起微流体装置并将其从微槽侧向下放置到盖玻片的中心。（图1A）
  4. 使用镊子的钝端将设备轻轻按压到盖玻片上，确保轻轻挤出任何气泡以确保密封。
  5. 将盖子放在培养皿上以保持无菌状态，并在光学显微镜下检查设备组件，以确保微槽和饲养池周围的紧密密封。＆nbsp;
  6. 返回无菌培养罩并用温热的喂养培养基灌注装置如下（图1B和1C）：
    1. 在左上方的水库中加入100μl温热的喂养培养基。注意确保介质进入并填充连接两个左侧储存器的通道。
    2. 等待2分钟以确保介质填充轴突通道和微槽。
    3. 接下来，在右上方的水库中加入100μl温热的培养基。
    4. 等待2分钟以确保介质填充了正常通道。
    5. 向左下和右下储液器各添加100μl温热介质。
    6. 将盖子放在固定装置的培养皿上，放置在细胞培养箱（37°C，5％CO 2 ）中至少1小时，然后铺设神经元。
  图1.使用培养基安装，定向和引发微流体装置的示意图。 A.将微流体装置放置在盖玻片上。 B.设备功能和方向。 C.添加到主要设备的媒体顺序。
6. 原代皮层神经元解剖和细胞制备
  在替补席上
  1. 按照已建立的实验室方法并根据符合匹兹堡大学实验动物研究部（DLAR）和机构动物护理要求的批准动物方案，人道地处死E18怀孕雌性大鼠并解剖胚胎大鼠原代皮质（脑膜移除）。和使用委员会（IACUC）。这些要求因机构而异。我们的方法改编自Ghosh和Greenberg（1995）描述的先前工作，并且如我们实验室先前所述（Arnold et al。，2011）。细胞产量变化，每个胚胎约0.5-1.0×10 6个细胞。
  2. 轻轻地将所有皮质转移到含有9ml HBSS解剖培养基的冰上的15ml锥形管中。
  3. 解剖完成后，移至无菌培养罩继续手术。
  在无菌培养罩中
  1. 使用移液管轻轻移除皮质中的HBSS并丢弃HBSS。
  2. 每次洗涤使用5 ml冷HBSS轻轻洗涤皮质3次。每次洗涤后，使用移液管轻轻从皮质中去除HBSS并丢弃。
  3. 在最后一次HBSS洗涤后，立即向皮质中加入5ml预热的酶溶液，并在37℃下孵育20分钟。
  4. 使用移液管移除酶溶液，立即将预热的光抑制剂溶液（10 ml）加入皮质中1分钟。
  5. 使用移液管移除光抑制剂溶液，立即将重抑制剂溶液（5 ml）加入皮质中，在37°C下保持2分钟。
  6. 使用移液管移除重抑制剂溶液，每次洗涤使用5 ml 37°C接种培养基轻轻洗涤皮质3次。每次洗涤后，使用移液管轻轻地从皮质中取出培养基并丢弃。
  7. 将新鲜的5ml种子培养基加入皮质中，使用P1000（1 ml）机械移液管，上下移液约20次，将组织和细胞团块分解成均质细胞悬液。如果细胞仍处于团块状态，您可能需要更长时间（5-10次）研磨，但不要过度研磨。细胞悬液应看起来混浊，并且不应留下明显的大颗粒或细胞团块。或者，在20次研磨后，细胞可以通过40μm无菌细胞过滤器筛。
  8. 统计细胞
    1. 将10μl等分试样的悬浮细胞与90μl种子培养基混合。
    2. 使用血细胞计数器计数细胞并计算悬浮液中的细胞/ ml。
电镀微流体装置
对于具有450μm或900μm宽度微槽屏障（Xona微流体）的标准2室微流体神经元装置，将初级皮层神经元以每个装置50,000个细胞铺板。为了确保电镀不会导致细胞被迫通过微槽进入设备的轴突，非细胞侧，请按照以下步骤进行（图2）：
1. 在种子培养基中将细胞悬浮液调节至2.5×10 6个/ ml细胞/ ml。每个待镀设备准备足够的20μl细胞溶液。搁置。
2. 从培养箱中取出固定有微流体装置的培养皿，并将它们放入无菌培养罩中。
3. 从所有储液器中取出用于灌注设备的所有介质。
4. 向每个装置的左上方储库（轴突侧）添加100μl进料培养基。
5. 向连接的左下方储液器（轴突侧）添加100μl进料培养基。等待1分钟使培养基在装置的轴突侧平衡。（见注释）
6. 在装置的最佳侧面，向右上方的水库（躯体侧）添加10μl细胞悬浮液。
  注意：将10μl细胞悬液置于储液器连接通道的连接处（见图2）。
7. 盖住固定装置的培养皿，并在光学显微镜下检查以确保细胞进入右上和右下贮存器之间的通道。（见注释）
8. 1分钟后，将另外10μl细胞悬浮液加入连接的右下方储液器（躯体侧）。
9. 将盖子放在固定装置的培养皿上，然后将其放回培养箱中。让细胞附着10分钟。
10. 10分钟后，将设备从培养箱中取出并返回无菌培养罩。
11. 轻轻地在左上方的水库（轴突侧）添加额外的100μl喂养培养基。
12. 轻轻地在连接的左下方储液器（轴突侧）添加额外的100μl进料培养基。
13. 在步骤E12之后，立即轻轻地将200μl喂养培养基添加到细胞侧右上方的储库（躯体侧）。＆nbsp;
14. 紧接着，轻轻地将200μl喂养培养基添加到连接的右下方水库（躯体侧）。
  注意：
  1. 添加媒体时要缓慢而温和;强力或过快地添加培养基会将细胞从通道中洗掉。
  2. 现在左边的每个水库都有200μl的饲喂培养基，右边的每个水库都有210μl的饲养培养基。
15. 将盖子放在固定设备的6厘米培养皿上。＆nbsp;
16. 将覆盖的6cm培养皿保持装置放入10cm培养皿中。最多三个6厘米的菜肴将放入一个10厘米的菜肴中。将盖子放在10厘米培养皿上，然后将设备放回培养箱中。这种盘碟系统用于在培养期间帮助减少蒸发并保持设备中的介质水平。
  
  图2.将神经元植入微流体装置的示意图
喂养维持和鱼藤酮治疗
1. 维护细胞
  1. 接种后，每3-4天在每个装置的四个贮存器中加入10μl喂养培养基，以维持培养基水平。将温热的培养基添加到无菌培养罩中的装置中。
  2. 在初始治疗之前不会发生媒体变化。
2. 慢性鱼藤酮和DMSO载体治疗
  在体外日 7（DIV7），通过在轴突侧和躯体侧储库中的1/2介质变化添加鱼藤酮或DMSO载体对照的初始处理，如下：＆nbsp;
  1. 在温热的喂养培养基中制备2倍浓度的所需最终鱼藤酮浓度（参见用于溶液制备的配方）。
  2. 同时，使用相应的2x浓度的DMSO作为载体对照制备温热的喂养培养基（参见用于溶液制备的配方）。
  3. 从培养箱中取出保持微流体装置的培养皿。
  4. 在无菌培养罩中，从每个装置上的四个贮存器中的每一个中移除100μl培养基。
  5. 对于每个装置，将100μl2x鱼藤酮或2x DMSO溶液添加到四个储库中的每一个中。
  6. 在整个装置中，最终浓度为1x鱼藤酮或1x DMSO。
3. 治疗持续1-2周，每3-4天使用1x浓度培养基更换½培养基。
  1. 在温热的饲喂培养基中制备1x浓度的所需最终鱼藤酮浓度和1x浓度的DMSO载体对照（参见用于溶液制备的配方）。
  2. 如上所述，对每个储液器重复½介质更换。
修复神经元（图3）
1. 在实验结束时，从所有储存器中移除介质。
2. 立即在左上和右上储液池中加入100μl温热的1x PBS。
3. 让PBS流到底部储液器1分钟。
4. 立即取出所有PBS。
5. 向每个顶部储液器中加入100μl温热的4％PFA。
6. 让细胞在室温下固定20分钟。
7. 删除所有PFA，并妥善处理。＆nbsp;
8. 向每个顶部储库中加入200μlPBS。
9. 冲洗5分钟。
10. 去除PBS冲洗液。
11. 重复PBS冲洗2次。
12. 用PBS填充每个储库。
13. 盖上装置，储存在4°C直至用于进一步分析。＆nbsp;
图3.固定微流体装置中神经元的示意图

重复使用微流体装置
如果培养物在实验性处理开始之前死亡，则装置没有适当地安装并且细胞进入装置的非细胞体侧，或者培养物不能用于实验，我们发现该装置可以重复使用成功。不要重复使用经过实验性处理的设备，如药物或有毒物质（见注释）。从安装有活性培养物的微流体装置开始，按照以下步骤重复使用设备：
1. 使用移液器从设备容器中取出介质。＆nbsp;
2. 将手指放在盖玻片的角上，然后使用镊子轻轻地抓住设备的边缘，并轻轻向上拉一定角度，直到设备没有盖玻片。
3. 用蒸馏水轻轻冲洗设备，然后将槽边朝上放入培养皿中。
4. 将设备浸入1x RBS清洁剂溶液中。盖上培养皿，在室温下在摇床上轻轻搅拌过夜。
5. 取出RBS清洁剂，用培养级水3次洗涤装置1小时，在室温下在摇床上轻轻搅拌。
6. 最后一次洗涤后，将设备浸没在水中，在光学显微镜下检查设备，以确认所有细胞碎片已从储存器和凹槽中移除。
7. 取下最后一次清洗，然后在无菌培养罩中进行剩余的步骤。
8. 将装置（槽侧朝上）转移到无菌培养皿中，然后将装置浸没在无菌培养级水中。盖上培养皿，在室温下在摇床上轻轻搅拌过夜。
9. 在无菌培养罩中，将装置从无菌洗涤液中取出，并在无菌培养皿中风干以储存以备将来使用，或者执行上述步骤C2中列出的灭菌程序以立即使用。

数据分析

在用于实验，数据采集和数据分析之前，请仔细检查设备和培养质量。在处理之前细胞出现明显窘迫的装置培养物不应用于实验或进一步分析。尽管设备的设计使得细胞不能穿过微通道，但是一些细胞偶尔会穿过微通道。特别是Glia能够容易地穿过。偶尔的神经元体细胞不是一个问题。如果经过一周的培养，您会注意到轴突侧有大量的神经元胞体，停止使用这种器械培养物。如果您在实验后发现轴突侧有许多somata，请不要使用此设备文化进行数据分析。轴突侧的大量somata可能表明电镀有问题（见注释）或装置没有正确连接到盖玻片上。

笔记

在微流体装置中电镀神经元（程序E）

细胞的铺板是维持体细胞和轴突之间隔离的关键步骤。确保装置的轴突室侧的储液器和通道在装置的正常隔室侧向储液器中添加细胞之前1-2分钟充满喂养介质。如果在添加细胞时轴突隔室是空的，则流体动力学将迫使分离的细胞通过微通道并进入轴突通道空间。如果发生这种情况，该装置及其神经元不能用于进一步的实验，因为轴突将不再是孤立的群体。（步骤E2-E3）
在步骤E4-E6中，当将细胞添加到装置的正常侧时，建议始终通过显微镜检查细胞是否进入正常的隔室侧通道。流体动力学应将细胞拉入通道。如果您没有观察到这一点，请返回无菌培养罩，尝试用移液管轻轻取出细胞。确保从右上方和右下方的水库中移除所有介质，并再次尝试将细胞放置在右上方的水库中，水库与水道连接。

重复使用微流体装置（程序H）

只有重复使用不的设备才能暴露于培养基中不常见的任何外源性处理，如药物，毒物（如鱼藤酮）或组织固定剂如PFA。如果在治疗实验期间已经使用过该装置，或者如果细胞和装置已暴露于固定剂，则该装置不能重复使用。因此，完成实验的任何设备都无法重复用于其他实验。
该再利用方法仅适用于压在细胞外基质涂覆的盖玻片上的微流体装置。如果使用等离子键合技术将器件绑定到盖玻片上（参见制造商的说明），则不能重复使用。
在我们的研究中，我们发现来自新设备和重复使用设备的培养物没有表现出任何可辨别的差异。此外，我们观察到在重新使用的设备中完成的新设备和实验中完成的实验所获得的结果没有差异。

食谱

0.1 M硼酸盐缓冲溶液
1. 在400 ml细胞培养级无菌H 2 O中加入1.24 g硼酸和1.002 g无水硼砂
2. 盖上并在室温下在搅拌板上搅拌过夜
3. 将pH调节至8.4
4. 在无菌培养罩中，过滤灭菌到高压灭菌的培养基瓶中
5. 在4°C下储存长达3个月
聚-D-赖氨酸2.5 mg / ml储备液
1. 将冷冻的冻干粉末在4℃下在冰上解冻过夜
2. 在无菌培养罩中准备库存
3. 向50mg聚-D-赖氨酸中加入20ml 0.1M无菌硼酸盐缓冲液
4. 在无菌培养罩中，使用10ml注射器和0.22μmPES注射器过滤器对储备溶液进行过滤灭菌
5. 将400μl原液分装到无菌微量离心管中
6. 储存在-80°C
聚-D-赖氨酸100μg/ ml涂层溶液
1. 在4°C冰上解冻一份Poly-D-Lysine储备液（400μl，2.5 mg / ml）过夜
2. 在无菌培养罩中，加入9.5ml无菌0.1M硼酸盐缓冲液
3. 最终浓度：100μg/ ml聚-D-赖氨酸
用于播种的皮质神经元培养基
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px; height：00px;” border =“0”cellspacing =“2”cellpadding =“6”>试剂
％vol / vol
500 ml
Neurobasal媒体
91.5％
457.5毫升
B27补充
2％
10毫升
Glutamax 100x
1％
5毫升
笔/ Strep
0.5％
2.5毫升
FBS
5％
25毫升注意：在无菌培养罩中准备所有溶液。＆nbsp;
1. 将所有试剂混合在无菌培养罩中，过滤灭菌到高压灭菌的培养瓶中
2. 在4°C下储存长达10天
用于喂养的皮质神经元培养基
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px; height：100px;” border =“0”cellspacing =“2”cellpadding =“6”>试剂
％vol / vol
500 ml
Neurobasal媒体
96.5％
457.5毫升
B27补充
2％
10毫升
Glutamax 100x
1％
5毫升
笔/ Strep
0.5％
2.5毫升
注意：在无菌培养罩中准备所有溶液。
1. 将试剂在无菌培养罩中混合，过滤灭菌到高压灭菌的培养基瓶中
2. 在4°C下储存长达10天
HBSS解剖媒体
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px; height：100px;” border =“0”cellspacing =“2”cellpadding =“6”>试剂
的金额。
最终结论
10倍HBSS
100毫升
1x
的NaHCO <子> 3 ＆NBSP; 350毫克
4.2 mM
HEPES，1 M
10毫升
10 mM
葡萄糖
4.3克
35 mM
用细胞培养级无菌H 2 O进行1L 注意：
1. 不要调节pH值。
2. 在无菌培养罩中准备所有溶液。
1. 将试剂在无菌培养罩中混合，过滤灭菌到高压灭菌的培养基瓶中。
2. 在4°C下储存长达3个月
解离媒体 class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px; height：100px;” border =“0”cellspacing =“2”cellpadding =“4”>试剂
的金额。
Na 2 SO 4 ，1M
20.44毫升
K 2 SO 4 ，0.5M
15毫升
MgCl 2 ，1M 1.45毫升
CaCl 2 ，100 mM
0.625毫升
HEPES，1 M
250μl
葡萄糖，1 M
5毫升
酚红，0.5％
0.5毫升
NaOH，0.1N
0.5毫升
用细胞培养级无菌H 2 O进行250ml 注意：
1. 不要调节pH值。
2. 在无菌培养罩中准备所有溶液。
1. 将试剂在无菌培养罩中混合，过滤灭菌到高压灭菌的培养基瓶中
2. 在4°C下储存长达3个月
L-Cysteine 50x库存
1. 称取160毫克，然后在无菌培养罩中制备
2. 溶于10ml无菌解离培养基中
3. 将样品置于225μl的无菌微量离心管中，并在-80℃下储存
木瓜蛋白酶解离溶液和抑制剂溶液分离原代大鼠皮层神经元
注意：
1. 在使用当天使这些解决方案变得新鲜。
2. 首先将解离培养基分装到无菌培养罩中的无菌15 ml锥形管中，用于下面的每种溶液。
3. 使用pH计在工作台上准备溶液。
4. 制备溶液后，返回无菌培养罩。
5. 对于每种溶液，使用10 ml无菌注射器和注射器过滤器将溶液无菌过滤到新的无菌15 ml锥形管中。
6. 在制备和最终pH调节后，使用10 ml注射器和0.22μmPES注射器过滤器，在无菌培养罩下将所有溶液过滤灭菌到新的无菌15 ml锥形瓶中。
1. 酶解决方案
  10毫升解离介质
  0.2毫升50倍半胱氨酸-HCl
  200 U木瓜蛋白酶溶液
  脉冲在涡旋混合器上
  用0.1N NaOH调节pH至7.4
2. 重抑制剂解决方案
  6毫升解离介质
  将60 mg BSA（4°C）加入6 ml DM中 60毫克大豆胰蛋白酶抑制剂（4°C）
  在涡旋混合器上脉动，然后放在振荡器上混合直至完全溶解在溶液中用0.1N NaOH调节pH至7.4
3. 光抑制剂解决方案
  9毫升解离介质
  加入1毫升重抑制剂溶液
  脉冲在涡旋混合器上
  用0.1N NaOH调节pH至7.4
Rotenone股票解决方案
1. 使用新鲜鱼藤酮和DMSO制备原料
2. 在DMSO中制备5 mM鱼藤酮＆nbsp;
3. 等分成100μl等分试样并储存在-20℃
4. 为所有实验准备足够的库存
Rotenone 2x和1x解决方案
1. 使用当天，使用前立即新鲜
2. 准备无菌培养罩
3. 在室温下解冻等份的5mM鱼藤酮，避光
4. 直接稀释至神经元喂养培养基至第一次治疗的最终所需治疗浓度的2倍，并用于后续治疗的1倍
DMSO车辆控制2x和1x解决方案
1. 使用当天，使用前立即新鲜
2. 准备无菌培养罩
3. 将DMSO直接稀释到神经元喂养培养基至第一次处理的最终所需处理浓度的2倍，并用于后续处理的1倍
4. 应制备载体对照培养基以具有与鱼藤酮处理培养基中相同的DMSO终浓度
4％PFA解决方案
准备2升4％PFA
200毫升10倍PBS
80克多聚甲醛
Milli-Q超纯水至2升
1. 准备化学通风橱＆nbsp;
2. 将1L超纯水加入带有大搅拌棒的2L烧瓶中
3. 加入112.5μl的10N NaOH
  注意：
  ＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;我。多聚甲醛在碱中比在酸中溶解更好。
  ＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;ⅱ。在此阶段省去PBS以消除缓冲。
4. 将温度计悬浮在溶液中并将烧瓶置于加热的搅拌板上并搅拌
5. 将溶液置于低于60°C并继续搅拌直至PFA溶解注意：密切监控;不要让多聚甲醛溶液超过60°C。
6. 当PFA溶解时，用pH试纸将pH值调至7.4 注意：请勿使用pH计。根据需要用HCl和NaOH调节pH。
7. 加入200毫升10倍PBS
8. 用超纯水将溶液加入2L
9. 用pH试纸重新检查pH值，确认最终pH值为7.4
10. 过滤灭菌并在50ml锥形管中制备40ml等分试样
11. 储存于-20°C直至使用

致谢

这项工作得到了NIH（R01NS077954，S.B.B。）和匹兹堡大学医学院学术基金会研究基金（S.B.B）的资助。
微流体装置电镀和培养方法改编自Park 等人（2006）所述的先前工作。
如Arnold et al。（2011）所述，我们之前的工作对慢性低剂量鱼藤酮暴露治疗方法进行了修改。

利益争夺

作者没有披露利益冲突。

伦理

所有动物程序均经匹兹堡大学的机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院在实验动物护理和使用指南中提出的指导。所有安乐死方法都与最新的美国兽医协会（AVMA）动物安乐死指南一致。

参考

Arnold，B.，Cassady，S.J。，VanLaar，V。S. and Berman，S。B.（2011）。整合神经元中线粒体动力学的多个方面：慢性鱼藤酮模型中与年龄相关的差异和动态变化。 Neurobiol Dis 41（1）：189-200。
Ghosh，A。和Greenberg，M。E.（1995）。神经元中的钙信号传导：分子机制和细胞结果。 Science 268（5208）：239-247。
Millet，L。J.和Gillette，M。U.（2012）。超过一个世纪的神经元培养：从悬滴到微流体装置。 Yale J Biol Med 85（4）：501-521。
Park，J.W.，Vahidi，B.，Taylor，A.M.，Rhee，S.W。和Jeon，N.L。（2006）。用于神经科学研究的微流体培养平台。 Nat Protoc 1 （4）：2128-2136。
Taylor，A.M.，Blurton-Jones，M.，Rhee，S.W.，Cribbs，D.H.，Cotman，C.W。和Jeon，N.L。（2005）。用于CNS轴突损伤，再生和转运的微流体培养平台。 Nat方法 2（8）：599-605。
Taylor，A.M.，Menon，S。和Gupton，S.L。（2015）。被动微流体室，用于长期成像轴突引导以响应可溶性梯度。 Lab Chip 15（13）：2781-2789。
Taylor，A.M.，Rhee，S.W.，Tu，C.H.，Cribbs，D.H.，Cotman，C.W。和Jeon，N.L。（2003）。用于神经科学研究的微流体多室设备。 Langmuir 19（ 5）：1551-1556。
Van Laar，V。S.和Berman，S。B.（2013）。神经元线粒体动力学和生物能量学的相互作用：对帕金森病的影响。 Neurobiol Dis 51：43-55。
Van Laar，V.S。，Arnold，B.，Howlett，E.H.，Calderon，M.J.，St Croix，C.M.，Greenamyre，J.T。，Sanders，L.H。和Berman，S.B。（2018）。分区轴突线粒体生物发生的证据：远端轴突线粒体DNA复制增加，作为对帕金森病的早期反应 - 相关的压力。 J Neurosci 38（34）：7505-7515。