材料和试剂

蛋白G琼脂糖珠（Upstate，Millipore Corporation，目录号：16-266）
二甲基嘧啶亚胺（Sigma-Aldrich）
硼酸钠
鲜花
乙醇胺
鲜花
蛋白酶抑制剂混合物，无EDTA（F.Hoffmann-La Roche，目录号：04693159001）
Benzonase核酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：E1014）
2-巯基乙醇
溴酚蓝
NP40
蔗糖
CaCl 2
MgOAc
EDTA
DTT
PMSF
DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
Laemmli缓冲液（见Recipes）
蔗糖缓冲液（参见配方）

设备

轮椅在寒冷的房间
冷冻离心机1.5 ml管

程序

抗体亲和柱
1. 在室温下温和摇动下，每1ml湿洗涤的蛋白G琼脂糖珠孵育5至10mg的抗体（Ab）1小时。 Ab和蛋白G琼脂糖珠的量变化并且取决于Ab的亲和力（参见注释1）。
2. 用3,000体积的0.2M硼酸钠（pH9.0）通过在3,000×3000g离心30秒来洗涤珠子两次。
3. 将珠子在10倍体积的0.2M硼酸钠（pH 9.0）中重悬，并保存1％的总珠体积（"等于"前）。加入二甲基庚二亚胺酯（固体）至20mM浓度。 pH是关键的，并且在加入二甲基庚二亚胺酸酯以有效偶联后应该高于8.3，并且可以例如用pH条指示剂检查。
4. 在室温下在摇床或摇床上混合30分钟。保存总珠体积的1％（等于"之后"）。
5. 以3,000x/min离心3分钟，弃去上清液。
6. 通过用等体积的0.2M乙醇胺（pH 8.0）洗涤珠一次来终止反应。以3,000x/min离心3分钟，弃去上清液。
7. 重复0.2 M乙醇胺洗涤一次，并在室温下温和混合孵育2小时
8. 用等体积的PBS洗涤珠子。以3,000x/min离心3分钟，弃去上清液。用PBS再次重复洗涤，然后将珠存储在具有所需体积的0.01％硫柳汞的PBS中。如果储存在4℃下，珠子可以稳定超过1年。
9. 通过在Laemmli缓冲液中偶联之前和之后煮沸的珠子样品检查偶联的效率。在10％SDS PAGE上运行并用考马斯蓝染色。在"之前"但不在"之后"泳道中由重链条（55kDa）指示良好的偶联。如果存在少量重链，在"之后"，通过在10,000xg离心30分钟，用100mM甘氨酸（pH 3.0）预洗涤偶联的珠子。以除去未与珠共价结合的任何残留抗体。然后用PBS洗涤珠子，然后将珠子存储在含有所需体积的0.01％硫柳汞的PBS中
核提取物准备
我们用来自患者T细胞淋巴母细胞的ALL-SIL和DND41细胞系使用该方案
1. 用冷的1×PBS洗涤细胞，然后在4℃下以1,200rpm离心6分钟。从现在开始，所有的步骤应该在冰上进行。
2. 在冷冻的蔗糖缓冲液（5μl/1×10 6个细胞）中重悬细胞沉淀。
3. 加入含有0.5％NP40（终浓度0.25％）的vol/vol蔗糖缓冲液
4. 通过在冰上吸移混合。保存一小份（1至5％ - 等分试样1）。
5. 在4℃下以1,100×em离心10分钟。颗粒含有核，看起来像白色的珍珠。上清液含有细胞质蛋白质提取物，如果细胞质蛋白质对Co-IP感兴趣，则可以保存上清液。保存一小份（1至5％ - 等份2）。
6. 用蔗糖缓冲液（不含NP40）洗涤沉淀，并在4℃下以2,000rpm离心10分钟。
7. 根据要纯化的核蛋白，你可以用
  裂解细胞核
  1. 可溶性蛋白的核裂解缓冲液（5μl/1×10 6个细胞）;
  2. 或用于难以提取蛋白质（5μl/1×10 6个细胞）的核裂解缓冲液，并加入DNA酶5U /μl和Benzonase 5U /μl。重悬是很困难的，因为它与DNA非常粘。
8. 在4℃下在轮上孵育45分钟至1小时。保存一小份（1至5％ - 等份3）。
9. 在4℃下以10,000×g离心3分钟。上清液是用于IP的蛋白质核提取物。从上清液（1至5％ - 等分试样4;其也是IP实验的输入）保存小等分试样，沉淀是不溶性物质例如膜碎片。将沉淀重悬在150μlNaCl，10mM Tris的5μl/1×10 6个细胞中。保存一小份（1至5％ - 等份5）。
10. 通过SDS-PAGE分析验证裂解效率，并通过Western-blot检测保存的等分试样中感兴趣的蛋白质的存在。
  1. 等分试样1：总细胞
  2. 等分试样2：细胞质蛋白提取物
  3. 等分试样3：总核提取物
  4. 等分试样4：核蛋白提取物
  5. 等分试样5：不溶性核提取物

免疫共沉淀
1. 将蛋白质核提取物与抗体结合的珠孵育。（Ab浓度需要通过实验确定。）需要对目的蛋白质的有效IP进行优化，并且Ab的量可以根据Ab的质量和亲和力，蛋白质G偶联，蛋白质稳定性等而变化。 br />
2. 在4℃下温和摇动孵育2小时
3. 在100mM NaCl，15mM Tris，HCl pH 7.8中洗涤4至6倍的珠子，通过吸移混合并在4℃下离心10,000×10 6秒30秒。
4. 洗脱在Laemmli上样缓冲液中的结合蛋白，并通过SDS-PAGE分离并通过western印迹分析

食谱

Laemmli缓冲区
20％甘油
4％SDS
250mM Tris（pH6.8）（SDS PAGE的上层凝胶的堆积缓冲液） 1.4 M 2-巯基乙醇，一小块溴酚蓝。
蔗糖缓冲剂
0.32 M蔗糖
3mM CaCl 2
2mM MgOAc
0.1mM EDTA
10 mM DTT
0.5 mM PMSF
难以提取核因子的核裂解缓冲液
50 mM Hepes（pH 7.8）<
3mM MgCl 2/
300 mM NaCl
1 mM DTT
0.1mM PMSF
蛋白酶抑制剂完全迷你EDTA免费药片1x
可溶性核因子的核裂解缓冲液
50 mM Hepes（pH 7.8）<
50 mM KCl
300 mM NaCl
0.1mM EDTA
10％甘油
1 mM DTT
0.1mM PMSF
蛋白酶抑制剂完全迷你EDTA免费药片1x

笔记

我们使用蛋白G琼脂糖珠与小鼠IgG1抗体。然而，所关注的同种型抗体的亲和力需要根据蛋白A或G制造商的建议来验证
用于蛋白质提取物的细胞的量可根据蛋白质的表达，稳定性而变化
Benzonase和DNase处理仅在难以提取粘附于核包涵体/核小体的蛋白质的情况下使用。如果感兴趣的蛋白质是可溶的，则优选使用核裂解缓冲液用于可溶性因子

致谢

在PF实验室的工作由"国家科学技术研究所"（Inserm）和"国家研究中心"（CNRS）的机构赠款以及欧洲共同体委员会的专项赠款，"国家癌症研究所"（INCa），"ITMO癌症联盟国家癌症联盟"（AVIESAN）和"Fondation Princesse Grace"摩纳哥公国"。 S.D.得到"精神病学研究所"，"法国医学研究基金会"和"法国医学会学会"的奖学金的支持。

参考文献

Dadi，S.，Le Noir，S.，Payet-Bornet，D.，Lhermitte，L.，Zacarias-Cabeza，J.，Bergeron，J.，Villarese，P.，Vachez，E.，Dik，WA，Millien C.，Radford，I.，Verhoeyen，E.，Cosset，FL，Petit，A.，Ifrah，N.，Dombret，H.，Hermine，O.，Spicuglia，S.，Langerak，AW，Macintyre，EA ，Nadel，B.，Ferrier，P。和Asnafi，V。（2012）。 TLX同源结构域致癌基因通过与ETS1的相互作用和TCRalpha基因的抑制来介导T-ALL中的T细胞成熟停滞表达。 Cancer Cell 21（4）：563-576。
Dignam，J.D.，Lebovitz，R.M.and Roeder，R.G。（1983）。通过RNA聚合酶II在来自分离的哺乳动物细胞核的可溶性提取物中的精确转录起始。 em> Nucleic Acids Res 11（5）：1475-1489。
Gersten，DM和Marchalonis，JJ（1978）。固相的快速，新颖的方法用于免疫亲和色谱的IgG抗体的衍生化。免疫方法 24（3-4）：305-309。
Schneider，C.，Newman，R.A.，Sutherland，D.R.，Asser，U.and Greaves，M.F。（1982）。使用高效免疫基质进行膜蛋白的一步纯化。 J Biol Chem 257（18）：10766-10769。
Simanis，V。和Lane，D.P。（1985）。 SV40大T抗原的免疫亲和纯化程序。病毒学 144（1）：88-100。