材料和试剂

移液器吸头（NIPPON Genetics Co.，Ltd。，目录号：FG-102，FG-301，FG-401）
牙签
Cuvettes（As One Corporation。，目录号：1-2855-02）
1.5毫升Microtube（BM Equipment Co.，Ltd。，目录号：NT-175）
50毫升离心管（Corning Incorporated，目录号：352196）
24孔组织培养试验板（BM Equipment Co.，Ltd。，目录号：92424）
灭菌塑料板（Φ90mm）（As One Corporation，目录号：GD90-15）
AnaeroPouch（Mitsubishi Gas，目录号：2-3764-02）
AnaeroPack（三菱燃气，目录号：2-3765-01）
℃。 merolae T1菌株（Taki et al。，2015）
Escherichia coli DH5α（Takara Bio，目录号：9057）
野生型 C. merolae DNA
鲑鱼精子DNA（FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries Corporation，目录号：047-17322）
质粒载体pMKT（Takemura et al。，2018;可根据要求提供给作者）
KOD-Plus-Neo DNA聚合酶（Toyobo，目录号：KOD-401）
GoTaq DNA聚合酶（Promega，目录号：M7123）
Stu I（NEB，目录号：R0187S）
Dpn I（Takara Bio，目录号：1235A）
特异性引物[用于扩增上游和下游片段的序列，用于 Stu I-消化的pMKT的同源序列（见图2A），在Integrated DNA Technologies（IDT）Inc。订购]
确认引物组（与同源区域的外部序列退火，参见图3，在Integrated DNA Technologies（IDT）Inc。订购）
用于菌落PCR的引物组（在Integrated DNA Technologies（IDT）Inc。订购）：
正向引物：5'-CGAGGTCGACGGTATCGATAAGC-3'
反向引物：5'-GATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3'
正向引物下降：5'-GCTGCTAGGGATTGTGGCGCGA-3'
向下反向引物：5'-CCGCTCTAGAACTAGTGGATCCC-3'
In-fusion HD克隆试剂盒（Takara Bio，目录号：639648）
苯酚，晶体（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：169-22445）
氯仿（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：035-02616）
异戊醇（3-甲基-1-丁醇）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：135-12015）
Trizma ® base初级标准品和缓冲剂，结晶（Sigma-Aldrich，目录号：T1503-500G）
HCl（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：081-03475）
十二烷基硫酸钠（SDS）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：194-13985）
NaOH（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：199-4895）
8-羟基喹啉（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：178-00752）
琼脂糖ME（岩井化学公司，目录号：50013R）
Wizard SV凝胶和PCR清理系统（Promega，目录号：A9281）
聚乙二醇4000（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：5322-68-3）
玉米淀粉（Kawamitsu-Bussan，目录号：4901 486 02701 6）
顶级淀粉溶液（Takemura et al。，2019）
结冷胶（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：073-03071）
Uracil（Sigma-Aldrich，目录号：U0750-5G）
5-氟乳清酸一水合物（5-FOA）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：066-03663）
醋酸钠（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：190-01071）
乙醇（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：055-00457）
（NH 4 ） 2 SO 4 （FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：019-03435）
MgSO 4 ∙7H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：138-00415）
H 2 SO 4 （FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：192-04696）
H 3 BO 3 （FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：021-02195）
MnCl 2 ∙4H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：133-00725）
ZnCl 2 （FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：268-01022）
Na 2 MoO 4 ∙2H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：198-02471）
CoCl 2 ∙6H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：038-03681）
CuCl 2 ∙2H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：039-04135）
KH 2 PO 4 （FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：169-04245）
CaCl 2 ∙2H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：038-19735）
FeCl 3 ∙6H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：090-02802）
Na 2 EDTA（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：345-01865）
DNA解决方案（见食谱）
PEG解决方案（见食谱）
MA2培养基（Kobayashi et al。，2010，见食谱）
1. MA2解决方案I
2. A6次盐
3. MA2解决方案II
4. MA2解决方案III
5. MA2解决方案IV
MA2固体结冷胶板（见食谱）
DNA提取缓冲液（见食谱）
中和酚（见食谱）

设备

移液器（Gilson，Inc.，目录号：F123600，F123601，F123602）
冷冻离心机（Koki Holdings Co.，Ltd.，型号：CF16RXII）
微量离心机（TOMY Seiko Co.，Ltd。，型号：MX150）
500毫升烧瓶（IWAI，目录号：4442FK500）
热块（千代田科技有限公司，型号：MiniT-100）
生物培养箱（TOMY Seiko Co.，Ltd.，型号：CLE-303）
NanoDrop（Thermo Fisher Scientific Inc.，型号：ND-LITE）
热循环仪（Bio-Rad Laboratories，Inc。，型号：T100热循环仪）
电泳仪（Atto Corporation，型号：WSE-1710）
FAS凝胶成像仪（Nippon Genetics Co.，Ltd。，型号：FAS-IV）
分光光度计（Beckman coulter，Inc。，型号：DU730，A23616）

程序

构建引入的DNA片段
构建概述：PCR扩增的DNA片段（基因组特异性基因座的同源区域的上游和下游）和 Stu I消化的pMKT（包括两个片段消化的载体L和S）使用In-fusion系统生成pMKT-UPandDOWN。所得质粒用作模板DNA，用于通过PCR扩增引入的DNA片段（图2）。
DNA片段的PCR扩增（图2A）：
1. 如下给出设计特异性引物组以扩增DNA片段（每个500-1,500bp）用于同源重组至基因组特异性基因座。上游和下游DNA片段不需要共享相同的长度。对于标记，上游DNA片段应包括缺乏终止密码子的开放阅读框，其与框架标签框内融合。每个有色区域（20bp）是相关末端的同源序列 Stu I-消化的pMKT（颜色对应于图2A）和每个重复的'Ns'（20-25bp）表示退火序列以扩增上游和下游DNA片段。每个引物的退火序列（'Ns'）的T m 应设计为高于63°C。
  上游前进（UF）：
  5' - GACACGTGAATTTAAATAGG NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
  上游反向（UR）：
  5' - TGAAAATAAAGATTTTCAGG NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
  下游前进（DF）：
  5' - AGGGATTGTGGCGCGACAGG NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
  下游反向（DR）：
  5' - GACACGTGAATTTAAATAGG NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
2. 使用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶在以下反应条件下进行PCR反应：94℃持续2分钟，然后进行30个循环：在98℃下10秒，在68℃下30秒/ 1kb，和使用特异性引物组（上游的UF / UR和下游的DF / DR）和50ng野生型 C在68℃下最终延伸2分钟/ 1kb。 merolae DNA作为模板。使用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System按照制造商的方案纯化PCR扩增的DNA片段，并测量DNA的浓度。
  注意：我们通常通过上述条件获得可重复的扩增结果。应通过凝胶电泳检查PCR结果以确认扩增。
通过 Stu I进行pMKT载体消化以获得两个DNA片段，这里称为消化载体L（长，约3.6kbp）和S（短，约3.0kbp，图2B）
1. 将1μgpMKTDNA在含有10单位 Stu I的50μl1xCutSmart缓冲液（即，提供 Stu I缓冲液）中孵育37 °C 1小时。
2. 加入100μldH 2 O和150μl苯酚：氯仿：异戊醇= 25：24：1溶液并剧烈混合。在室温下以12,000 x g 离心10分钟。取150μl上清液，加入15μl3M乙酸钠和375μl100％EtOH。剧烈混合并在4,000℃下以12,000 x g 离心30分钟。弃去上清液，向沉淀中加入75％EtOH，并在4℃下以12,000 x g 离心5分钟。弃去上清液，在冲洗离心后用移液管完全除去剩余的液滴，并在室温下在工作台上短暂风干颗粒。然后加入20μldH 2 O并溶解沉淀的DNA。测量DNA浓度。
  注意：使用苯酚 - 氯仿 - 异戊醇时，需要根据当地的健康和安全法规使用个人防护设备。总是在通风橱下工作。
融合反应产生模板质粒（图2C）
1. 轻轻混合5μlDNA混合物[ Stu I消化的pMKT（消化的载体L和S）：上游：下游≈100fmol：50 fmol：50 fmol]和5μl2xIn-fusion反应混合。将反应混合物在50℃孵育15分钟，然后在冰上冷却。
2. 用常规使用的化学转化方法用反应混合物转化大肠杆菌DH5α。通过菌落PCR找到预期的质粒构建体。使用GoTaq DNA聚合酶在以下反应条件下进行PCR反应：95℃持续3分钟，然后进行30个循环：在95℃下30秒，在55℃下30秒，在72℃下1分钟/ 1kb。用引物组在72℃最终延伸2分钟（向前引物：5'-CGAGGTCGACGGTATCGATAAGC-3'/反向引物用于上游：5'-GATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3'用于上游序列，和正向引物用于向下：5'-GCTGCTAGGGATTGTGGCGCGA-3'/用于向下的反向引物：用于下游序列的5'-CCGCTCTAGAACTAGTGGATCCC-3'。随后，通过用于菌落PCR的引物组进行DNA序列分析来检查阳性候选物。＆nbsp;
3. 提取并纯化质粒DNA（pMKT-UPandDOWN）。
通过PCR扩增DNA进行转化以制备线性化DNA片段并完全去除模板环状质粒DNA（图2D）
注意：经常包含模板质粒DNA可能导致质粒随机整合到基因组中。因此，应小心移除模板质粒DNA。

图2.模板载体（pMKT-UPandDOWN）和用于转化的DNA构建体的概述。 A.对应于靶基因的DNA区域（上游和下游）通过PCR扩增，具有特定的引物组pMKT的20bp同源序列（显示为红色，蓝色，绿色和黄色）。 B.用 Stu I酶消化pMKT载体，在其长度（L-long; S-short）后产生2个名为消化的载体L和S的DNA片段。红色阴影区域表示同源重复序列（，即URA5.3 终止子区域）。 C.使用In-融合系统将四个DNA片段（消化的载体L，消化的载体S，上游和下游）连接在一个反应管中，以制备质粒pMKT-UP和DOWN）。 D.使用pMKT-UPandDOWN作为模板，用引物组UF和DR通过PCR扩增用于转化的DNA片段。
1. 如步骤A2中所述进行PCR，其中特异性引物组（上游前向：UF和下游反向：DR）和pMKT-UPandDOWN作为模板。＆nbsp;
2. 为了消化质粒DNA，将扩增的PCR混合物用10单位的 Dpn I在37°C处理1小时。＆nbsp;
3. 在1.2％琼脂糖电泳（施加100V电压30分钟）后，使用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System纯化特异性条带。制备2-5μgDNA片段，用于在40μldH 2 O中转化。
C的转换。 merolae 细胞
转换 C。按照Ohnuma 等人（2008）和Fujiwara和Ohnuma（2018）所述的聚乙二醇介导的方案遵循merolae T1细胞。
1. 当OD 750 达到~10时，将细胞培养物稀释在50ml MA2培养基中，得到OD 750 0.4，并在玻璃圆筒中培养（直径3cm，35在恒定光照下，在空气中用2％CO 2 鼓泡的棉塞（20μmol光子m -2 s -1 ）在40°C下保持20-24小时。
2. 通过离心（1,200 x g ，在40℃下5分钟）收获细胞（OD 750 <0.7），并弃去上清液。用200-300μlMA2培养基重悬沉淀。
3. 将2-5μgDNA片段在40μldH 2 O和60μlDNA溶液中混合（参见配方）。
4. 将25μl重悬浮的细胞加入管中并轻轻混合。
5. 立即加入125μlPEG溶液（参见食谱），用200μl移液管轻轻移液4-5次，混合液体。
6. 将混合物转移至30-40ml MA2培养基中，并在与步骤E1中所述相同的条件下孵育20-24小时。
7. 通过离心（1,200 xg ，在40℃下5分钟）收获培养的细胞，并通过顶部淀粉方法将细胞铺展到不含尿嘧啶和5-FOA的MA2固体结冷胶板上以增加电镀效率（Takemura et al。，2019）。在AnaeroPack中使用AnaeroPouch在40°C下补充5％CO 2 孵育平板。＆nbsp;
8. 2-4周后，菌落将出现在MA2固体结冷胶板的表面上。
9. 使用灭菌牙签挑取分离良好的菌落（通常20-24个候选菌株），并接种在24孔组织培养试验板中制备的2ml MA2液体培养基。
10. 在不搅拌的情况下在相同的培养箱中孵育1-2周后，收获20-24个候选菌落并如下所述提取DNA（Kobayashi 等人，，2010）。为了选择阳性转化体，使用''确认引物组'用DNA进行PCR以退火到用于引入DNA片段的同源区域的外部序列（图3）。使用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶在以下反应条件下进行PCR反应：94℃持续2分钟，然后进行30个循环：在98℃下10秒，在68℃下30秒/ 1kb，和在68°C下最终延伸2分钟/ 1 kb。
从 C中提取DNA。 merolae 细胞
1. 收获 C.通过在4℃下以3,000μL离心5分钟离心5分钟的merolae 细胞，并丢弃培养基。
2. 用400μlDNA提取缓冲液[50mM Tris-HCl（pH = 8.0），5mM EDTA，0.5％十二烷基硫酸钠]重悬细胞沉淀。
3. 加入400μl中和的苯酚。
4. 在65°C孵育10分钟，每2分钟用手剧烈摇动。
  注意：不应使用漩涡。
5. 在室温下以12,000 x g 离心5分钟。将375μl上述水相转移到新管中，并加入375μlPCI（中和的苯酚：氯仿：异戊醇= 25：24：1）。用力手动翻转管子。
6. 在室温下以12,000 x g 离心5分钟。将350μl上述水相转移到新管中，并加入350μlPCI。用力手动翻转管子。
7. 在室温下以12,000 x g 离心5分钟。将300μl上述水相转移到新管中，并加入30μl3M乙酸钠和750μl100％乙醇。用力手动翻转管子。
8. 在4℃下以12,000 x g 离心30分钟。弃上清，加入200μl75％乙醇。
9. 在12,000 x g 下在4℃下离心5分钟。弃去上清液，让液体完全蒸发。
10. 将DNA沉淀溶解在蒸馏水中。
  注意：使用苯酚 - 氯仿 - 异戊醇时，需要根据当地的健康和安全法规使用个人防护设备。总是在通风橱下工作。
从基因组中消除 URA5.3 基因标记
1. 使用 URA5.3T 作为基因选择标记的转化体细胞在50ml MA2培养基中培养直至OD 750 达到0.5-5.0。
2. 将离心的50ml培养物在1200℃下在40℃下离心5分钟。
3. 弃去上清液，加入1.5ml MA2培养基并重悬沉淀的细胞。
4. 将1ml顶部淀粉溶液（Takemura et al。，2019）加入1ml细胞悬浮液中，轻轻混合，涂在含有0.5mg / ml尿嘧啶的MA2固体结冷胶板上。 0.8 mg / ml 5-FOA。＆nbsp;
5. 向剩余的细胞悬浮液中加入1ml MA2培养基。取1 ml稀释的细胞悬浮液，按步骤F4涂抹在MA2固体结冷胶板上。＆nbsp;
6. 2-4周后， URA5.3 的菌落消除细胞出现在MA2固体结冷胶板上。
7. 使用灭菌牙签挑取分离良好的菌落（通常为20-24个候选菌），并将其各自接种在24孔组织培养试验板中制备的2ml MA2液体培养基中。
8. 在相同的培养箱中孵育1-2周后，如步骤E10所述从每个绿色接种物中提取DNA。以确认 URA5.3 消除，如步骤E10所述的使用所述“确认引物组”退火至用于引入DNA片段的同源区的外侧序列的DNA进行PCR（图3）。
9. 确认后的 URA5.3 消除通过PCR，使用菌株是准备进行下一次转化实验 URA5.3T 作为基因选择标记。
  
  的图3中的变换的确认的示意图和的 URA5.3 的消除由PCR A.示意图对于宿主菌株的修饰基因座，第一转化体和 URA5.3 消除了转化体。箭头表示用于确认转化的特异性引物组（命名为“确认引物组”）。应设计这些引物以与同源区域的外部序列退火。 B.使用确认引物组确认预期重组事件的PCR凝胶电泳图像的实例。＆nbsp;

食谱

DNA解决方案
1. 在1.5 ml微管中混合34μldH 2 O和6μl10xMA2溶液I
2. 向上述微管中加入20μl10mg/ ml鲑鱼精子DNA
3. 将微管在40°C孵育直至使用
注意：此溶液应在通风橱下使用时准备好。
PEG解决方案
1. 在1.5ml微管中取0.6g聚乙二醇4000
2. 向微管中加入470μl10xMA2溶液I.
3. 将微管在65℃下孵育10分钟，每2分钟用手摇动一次
注意：此溶液应在通风橱下使用时准备好。
MA2培养基
1. 将100ml MA2溶液I，10ml MA2溶液II，1ml MA2溶液III和885ml dH 2 O混合到玻璃瓶中，并通过在121℃高压灭菌20分钟进行灭菌。
2. 向混合物中加入4ml MA2溶液IV
  MA2解决方案我
  
  A6次盐
  
  MA2解决方案II
  
  MA2解决方案III
  
  MA2解决方案IV
  
  注意：此MA2溶液IV应通过过滤灭菌，并在4°C黑暗中储存。
MA2固体结冷胶板（用于制作9-10个板）
1. 在500ml烧瓶中混合30ml MA2溶液I，3ml MA2溶液II，300μlMA2溶液III和70ml dH2S O.在另一个500ml烧瓶中混合200ml dH 2 O和1.5g结冷胶。通过高压灭菌消毒这些烧瓶
2. 高压灭菌后，将每种溶液与1.2ml MA2溶液IV在一个烧瓶中混合。在5-FOA选择的情况下，直接向烧瓶中加入150毫克尿嘧啶（终浓度：0.5毫克/毫升）和240毫克5-FOA（终浓度：0.8毫克/毫升）粉末
3. 将混合溶液倒入灭菌的塑料板上
4. 在室温下干燥板15分钟
5. 如果要储存板，则应将它们保存在4°C的黑暗中
DNA提取缓冲液
1. 将12.1克Trizma ®碱溶于玻璃瓶中的100毫升dH 2 O中，用HCl调节pH至8.0，制成1M Tris-HCl（pH = 8.0））解决方案。通过高压灭菌消毒
2. 将10.0g十二烷基硫酸钠溶于玻璃瓶中的100ml dH 2 O中，制成10％SDS溶液
3. 将18.6g EDTA∙2Na溶解在玻璃瓶中的100ml dH 2 O中并用NaOH调节pH至8.0以制备0.5M EDTA溶液。通过高压灭菌消毒
4. 在玻璃瓶中混合5毫升1M Tris-HCl（pH = 8.0）溶液，5毫升10％SDS溶液，1毫升0.5M EDTA溶液和89毫升dH 2 O
5. 在室温下储存
中和的苯酚
1. 通过在65℃加热将100g苯酚溶解在200ml玻璃瓶中
2. 溶解苯酚后，向苯酚中加入0.1g 8-羟基喹啉
3. 将50ml 1M Tris-HCl（pH = 8.0）溶液和50ml dH 2 O的混合物加入到苯酚中并在室温下充分混合5分钟
4. 混合后，在室温下孵育酚混合物10分钟
5. 去除80毫升上层相（液体层）
6. 将50ml 1M Tris-HCl（pH = 8.0）溶液和50ml dH 2 O的混合物加入到苯酚中并在室温下充分混合5分钟
7. 混合后，在室温下孵育酚混合物10分钟
8. 去除100毫升上层相（液体层）
9. 在黑暗中于4°C储存
注意：使用苯酚 - 氯仿 - 异戊醇时，需要根据当地的健康和安全法规使用个人防护设备。总是在通风橱下工作。

致谢

该方案改编自（Takemura et al。，2018和2019）。作者感谢东京工业大学DNA序列分析生物材料分析部门。该研究得到MEXT / JSPS KAKENHI（授权号：15K14539至K.T.，17K07438至S.I.，17K07439至Y.K.）和日本科学技术厅（JST）的先进低碳技术研究与开发计划（ALCA）至K.T.的支持。

利益争夺

没有宣布竞争利益。

参考

Fujiwara，T.，Ohnuma，M.，Kuroiwa，T.，Ohbayashi，R.，Hirooka，S。和Miyagishima，S。Y.（2017）。基于新建立的氯霉素，通过两步转化开发双核基因靶向方法 - 红藻中的选择系统 Cyanidioschyzon merolae 。 Front Plant Sci 8：343。
Kobayashi，Y.，Ohnuma，M.，Kuroiwa，T.，Tanaka，K。和Hanaoka，M。（2010）单细胞红藻 Cyanidioschyzon merolae 的培养和分子遗传分析的基础。 Endocytobiosis Cell Res 20：53-61。
Minoda，A.，Sakagami，R.，Yagisawa，F.，Kuroiwa，T。和Tanaka，K。（2004）。通过红藻中的同源重组改善培养条件和核转化证据， Cyanidioschyzon merolae 10D。植物细胞生理学 45（6）：667-671。
Fujiwara，T。和Ohnuma，M。（2018）。转换程序及其在 Cyanidioschyzon merolae中的应用
Ohnuma，M.，Yokoyama，T.，Inouye，T.，Sekine，Y。和Tanaka，K。（2008）。聚乙二醇（PEG）介导的红藻中的瞬时基因表达， Cyanidioschyzon merolae 10D。植物细胞生理学 49（1）：117-120。
Takemura，T.，Imamura，S.，Kobayashi，Y。和Tanaka，K。（2018）。选择性标记物回收系统的构建以及单细胞红中多个核基因的表位标记的用途alga Cyanidioschyzon merolae 。植物细胞生理学 59（11）：2308-2316。
Takemura，T.，Imamura，S.，Kobayashi，Y。和Tanaka，K。（2019）。用于有效培养单细胞红藻 Cyanidioschyzon merolae 的顶级淀粉接种方法。生物协议 9（4）：e3172。
Taki，K.，Sone，T.，Kobayashi，Y.，Watanabe，S.，Imamura，S。和Tanaka，K。（2015）。构建单细胞红藻的 URA5.3 缺失株 Cyanidioschyzon merolae ：用于转化实验的无背景宿主菌株。 J Gen Appl Microbiol 61（5）：211-214。