材料和试剂

纯化蛋白作为配体
合成肽溶于DMSO作为分析物
NaCl
NaOH
HEPES
吐温-20
50 mM NaOH
胺偶联试剂盒{750mg EDC（N-乙基-N' - （3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐），115mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），10.5ml乙醇胺-HCl; GE Healthcare，目录号：BR-10000-50}
10mM乙酸盐缓冲液pH4至5.5（GE Healthcare，目录号：BR-1003-49至52）
DMSO（高级，如Sigma-Aldrich，目录号：276855或Sigma-Aldrich，目录号：D-1435）
MilliQ水
固定试剂（见配方）
结合测定试剂（参见配方）
配体（见配方）
分析物（参见配方）

设备

CM5传感器芯片（研究级; GE Healthcare，目录号：BR-1003-99）
Biacore X100评估软件（GE Healthcare）

程序

pH检测（测定配体的最佳pH）
带正电荷的配体静电耦合到传感器芯片的带负电荷的表面，导致配体浓度。进行pH研究以确定浓集配体的pH范围
在不同pH的10mM乙酸盐缓冲液中稀释配体至终浓度为5-200μg/ml（对于难以浓缩的配体，更高的蛋白质浓度是必需的）。在每个pH研究步骤之后进行使用50mM NaOH的再生步骤下面是配体到传感器芯片的pH研究的实例
固定
在最佳pH和浓度下制备配体。最佳pH是允许pH监测中的配体浓度的最高pH。例如，pH5是图1所示配体的最佳pH

图1. pH检测
下面是配体固定到传感器芯片的实例

* EDC：N-乙基-N' - （3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐 NHS：N-羟基琥珀酰亚胺这两种和乙醇胺在胺偶联试剂盒
中提供 **流动池1用作参考池。

固定后，运行1×运行缓冲液固定（1×RB-i）以10μl/min，直到基线稳定。典型的固定读数如图2所示。

图2.固定
分析物准备
准确的样品制备需要准确的测量，特别是当分析物溶解在有机溶剂中。即使样品和运行缓冲液之间的有机溶剂浓度的微小差异也导致不准确。
下面是我们如何匹配我们的样品的DMSO浓度
1. 用MilliQ水稀释10x HBS缓冲液，用0.11％Tween-20稀释Tween-20至1.1x HBS缓冲液。
2. 将25ml DMSO和25ml MilliQ水加入到450ml具有0.11％Tween-20的1.1x HBS缓冲液中，以制备用于结合测定的1x运行缓冲液（1×RB-b）。
3. 用MilliQ水将DMSO中的10mM肽稀释至5mM，并用含有0.11％Tween20的1.1x HBS缓冲液进一步稀释至500μM（这使得1x RB-b中的500μM肽）。
4. 用1x RB-b稀释500μM肽混合物至12.5μM，然后用1x RB-b两倍稀释至0.39μM。
再生条件
对于具有缓慢解离的分析物（当在解离步骤结束时传感图不回到背景水平）时，必须在每次结合测定后进行再生步骤。确定每个分析物的最佳再生条件。再生不应改变固定化配体的活性（即，在再生之前和之后从结合测定获得的反应应该是相同的）。
结合测定
用1x RB-b进行结合测定。
以下是结合测定的实例。

使用Biacore X100评估软件（GE Healthcare）进行数据分析。
蛋白质 - 肽相互作用的传感图显示在图3和参考文献中（Eguchi等人，2012）。

图3.结合测定

食谱

用于固定和结合的缓冲液必须针对每种配体和分析物进行优化。以下配方与我们的蛋白质和肽样品配合使用。

用于固定的试剂
1x运行缓冲液（1x RB-i）
10mM HEPES（pH7.5） 150mM NaCl 0.05％Tween-20
用于结合测定的试剂
10×HBS缓冲液[100mM HEPES（pH7.5），1.5M NaCl] 1×用于结合测定的运行缓冲液（1x RB-b）
10mM HEPES（pH7.5）
150mM NaCl 0.1％Tween-20
5％DMSO
配体
用1x RB-i平衡的纯化蛋白（纯度> 90％）
分析物
合成肽溶于DMSO

致谢

该方案改编自Eguchi等人（2012），并且通常遵循Biacore X100（GE Healthcare）的"仪器手册"。这项工作得到了日本科学促进会（JSPS），新生物产业发展研究与开发计划（2006-2010）的科学研究助学金（A，20248012）的支持 - 日本技术研究推进机构（BRAIN），2011 - 2015年私立大学战略研究基金会支持计划（S1101035），日本科学协会Sasakawa科学研究资助和大阪发酵研究所。

参考文献

Eguchi，Y.，Ishii，E.，Yamane，M。和Utsumi，R。（2012）。连接器SafA与大肠杆菌中PhoQ的多重感测结构域相互作用。 em> Mol Microbiol 85（2）：299-313。