材料和试剂

PCR反应条（8 x 0.2 ml）连接平盖（Simport，目录号：T320-2N）
1.7 ml微量离心管（Corning，目录号：MCT-175-C）
15毫升塑料管（康宁牌，目录号：352196）＆nbsp;
显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-550-15）或凹面显微镜载玻片（United Scientific Supplies，目录号：CS3X11）
显微镜盖玻片（例如>，VWR，目录号：48366 045）
显微镜小培养皿托盘（MatTek Corp，目录号：P35GC-1.5-10-C）
培养皿（Corning Brand，目录号：351029）或任何其他容器
感兴趣的样本
注意：该方案针对具有相对低的天然色素沉着的小（<30mm）样品进行了优化。高透明度。该方案可用于其他标本，但可能需要进一步优化免疫染色和图像采集。>＆nbsp;
去离子（DI）水
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning Incorporated，目录号：46-013-CM）
20％多聚甲醛（PFA）（Electron Microscopy Sciences，目录号：15713）
200-proof（100％）乙醇（Decon Laboratories，目录号：2701）
30％（w / v）过氧化氢（Sigma-Aldrich，目录号：H3410）
α5Na + / K + ATPase（NKA）抗体（Developmental Studies Hybridoma Bank，目录号：a5-上清液）
注意：>
1. 这种单克隆抗体特异性识别来自多种水生生物的NKA，包括：骨鱼（Wilson > et al。> ，2000和2002; Yang > et al。> ，2013; Tang > et al。> ，2014; Kwan > et al。 > ，2019年），elasmobranch鱼类（Piermarini和Evans，2001; Roa > 等。> ，2014; Roa和Tresguerres，2017）和hagfish（Clifford < / em> et al。> ，2015）。>
2. 该方案可以在感兴趣的物种中的一抗验证后适用于其他蛋白质。然而，使用不同的一抗成功定位可能需要优化此处描述的固定和免疫组化程序。>
Vectastain ® Elite ® ABC HRP即用型试剂盒（Vector Laboratories，目录号：PK-7200），包括：
1. 正常马血清阻断液
2. 泛特异性二抗溶液＆nbsp;
3. 链霉抗生物素蛋白过氧化物酶溶液
3,3-二氨基联苯胺（DAB）过氧化物酶底物储存于4°C（Vector Laboratories，目录号：SK-4100）
叠氮化钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S227I-25）
1.2x磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（见食谱）
4％多聚甲醛（PFA）固定液（见食谱）
3％过氧化氢溶液（见食谱）
1.0x PBS解决方案（参见食谱）
DAB底物工作液（见食谱）
10％叠氮化钠储备液（见食谱）
0.02％叠氮化钠工作液（见食谱）

设备

冰箱（4°C）和冰柜（-80°C）
化学通风橱
硼硅酸盐玻璃小瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：033374）
振动台（例如>，VWR，标准轨道振动器，型号1000）或旋转器（例如>，Thermo Fisher Scientific，Tube Revolver / Rotator，目录号：88881001）
转移移液管（Thermo Fisher Scientific，目录号：1368050）或适合您感兴趣标本的任何其他移液器
精细镊子（精细科学工具，目录号：26029-10）或任何不会损坏您感兴趣的样本的镊子
安装在相机上的显微镜用于较小样品的Leica DMR复合显微镜（<5 mm SL），用于较大样品的Leica MZ9.5立体显微镜（> 5 mm）
显微镜光源（Ludl Electronic Products [LEP] [12 V，100 W]，目录号：99019）
显微镜安装摄像头（佳能，Rebel T3i单反相机）
兼容相机与SD卡
用于显微镜成像的抗振动台
显微镜级千分尺标准
监视显微镜摄像机的实时馈送成像
用于无线快门释放的相机遥控器（佳能RC-6）

软件

Helicon Focus（HeliconSoft，版本6.7.2或更高版本， www.heliconsoft.com ）
Adobe Photoshop（Adobe Systems，CS3或更高版本， www.adobe.com ）
斐济（ https://imagej.net/Fiji ）或ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）带有单元格计数器插件（ https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ）
Adobe Illustrator（Adobe Systems，版本19.2.0或更高版本， www.adobe.com ）
R（ https://www.r-project.org ）

程序

该协议的概述如下所示（图1）。完成此程序所需的时间因每个样本的大小而异。至少，此程序至少需要3天。

图1.程序概述。示意图显示了该协议的主要步骤。

样品固定
1. 按照批准的动物护理协议对标本进行安乐死。
2. 将样品在固定溶液（参见配方1和2）中在旋转器/摇动台上的任何不透水容器（例如>，硼硅酸盐玻璃瓶）中孵育过夜（8-12小时），温度为4°C。
  注意：>
  1. 所有样品应完全浸入固定剂中。多个样品可以固定在一起。在Kwan > 等人> ，2019年，将6-10只鱼幼虫（长度为3-25毫米）固定在20毫升硼硅酸盐玻璃中的10毫升固定剂中小瓶。根据您感兴趣的样本调整容器，体积和固定剂。不需要在固定之前冲洗样品。>
  2. 如果要立即处理样品用于免疫组织化学，可以用三次10分钟PBS洗涤替换乙醇洗涤（步骤A3和A4）。>
3. 取出固定剂，然后在摇床上将样品在50％乙醇中孵育过夜（8-12小时），温度为4°C。
4. 去除50％乙醇，然后在70％乙醇中孵育样品，在4°C下长期储存。
整体免疫组织化学
1. 通过用自来水转移到培养皿上1分钟开始再水化样品。
2. 初次冲洗后，用自来水（填充至最大体积）将样品转移到塑料管（例如>，0.2 ml PCR管或1.7 ml微量离心管，具体取决于幼虫大小）中，并进一步在10分钟内孵育10分钟。旋转/摇床上的室温。
  注意：>
  1. 所有样品应完全浸入溶液中。在Kwan > 等人> ，2019中，将鱼幼虫（长度<20mm）在1.7ml微量离心管中温育并浸入~1ml溶液中。较大的样品将需要更大的容器和更多的解决方案（反之亦然）。相应地调整容器和溶液体积。>
  2. 在溶液更换期间，优选从容器中取出溶液 - 而不是将样品移至具有不同溶液的容器中。这最大限度地减少了对样品的损害。这适用于所有解决方案更改。>
  3. 如果使用塑料移液管更换溶液会出现问题，请考虑使用尺寸更合适的移液器（P200移液器，200 ml尖端用于0.2 ml PCR管，P1000移液器用1000μl吸头）更换溶液。根据样品和/或容器进行调整。>
3. 除去水，然后在室温下在旋转器/摇动台上将样品在新制备的3％过氧化氢（参见配方3）中孵育10分钟。
  注意：>
  1. 在溶液更换期间，优选从容器中取出溶液 - 而不是将样品移至具有不同溶液的容器中。这最大限度地减少了对样品的损害。这适用于所有解决方案更改。>
  2. 如果有强烈色素沉着和/或非特异性背景染色，此步骤可延长至1小时。>
4. 除去3％过氧化氢溶液，然后在室温下在旋转器/摇动台上将样品在正常马血清（NHS）封闭溶液中孵育15分钟。
5. 制备一抗溶液（例如>，α5NKA抗体：在NHS封闭溶液中20ng / ml）。
6. 去除NHS，然后在一抗溶液中孵育样品，并在室温或（优选）4°C下在旋转器/摇床上放置过夜（≥8小时）。
  注意：可以针对各种抗体验证对照修改该步骤。有关详细信息，请参阅程序K. >
7. 去除一抗溶液，然后在室温下在旋转器/摇动台上用1x PBS（参见配方4）冲洗样品5分钟。重复两次，总共三次冲洗。
8. 取出1x PBS洗液，然后在室温下在旋转器/摇动台上将样品在泛特异性二抗溶液中孵育30分钟。
9. 去除泛特异性二抗溶液，然后在室温下在旋转器/摇床上用1x PBS冲洗样品5分钟。重复两次，总共三次冲洗。
10. 取出1x PBS洗液，然后在室温下在旋转器/摇动台上将样品在链霉抗生物素蛋白过氧化物酶溶液中孵育15分钟。
11. 去除链霉抗生物素蛋白过氧化物酶溶液，然后在室温下在旋转器/摇动台上用1x PBS冲洗样品5分钟。重复两次，总共三次冲洗。
12. 根据制造商的说明，在单独的容器（例如>，15 ml离心管）中制备DAB底物工作溶液（参见配方5）。
13. 取出1x PBS洗液，然后在室温下将样品在DAB底物工作溶液中孵育20秒。
  注意：>
  1. 该部分的敏感性高度依赖于感兴趣的组织样品和抗体。因为DAB染色是不可逆的，所以如果需要更深染色，则从20秒开始并增加孵育时间。最佳培养时间应由研究人员确定。>
  2. 孵育样本的时间较长可能会导致背景染色较深。如果这成为问题，请考虑用去离子水稀释DAB底物工作溶液。>
14. 除去DAB底物工作溶液，然后在室温下在旋转器/摇动台上用去离子水冲洗样品10分钟。重复两次，总共三次冲洗。
15. 储存在4°C的去离子水中直至成像。
16. 如需长期储存（1周或更长时间），请使用PBS + 0.02％叠氮化钠（参见食谱6和7）。
  注意：叠氮化钠毒性很大。在处理和成像之前，应在叠氮化钠中孵育的样品应进行多次去离子水洗涤。>
光学显微镜和成像
1. 小心地将样品转移到显微镜载玻片，凹面显微镜载玻片或玻璃底皿上，在光学显微镜下检查。
2. 加入去离子水以防止样品变干，并用盖玻片固定样品以防止意外移动。
3. 打开DSLR相机上的实时馈送选项。
4. 关闭DSLR相机上的自动对焦选项。
5. 将相机设置为手动或光圈优先模式。调整以下参数，直到图像最佳：相机ISO，相机光圈，显微镜光圈，光源亮度。
6. 为获得最佳成像效果，请使用无线遥控器触发快门释放。
  注意：避免撞到整个相机设备。由于每张照片的曝光时间可能需要每张图像约1秒，因此显微镜，样品，相机和周围环境的任何移动都会导致模糊。>
7. 从一端（例如>，鱼标本的头部）开始，在视野内的每个焦平面（Z-堆叠）处拍摄样本。手动调整焦距，直到整个Z-stack完成（图2A-2E）。小心不要在X或Y维度上移动图像。
  注意：>
  1. 显微镜镜头和相机之间的图像可能不同（在实时供纸监视器上显示）。始终使用相机的焦平面并相应地拍摄图像。>
  2. 最好按连续顺序拍摄Z-stack（从前到后，反之亦然），因为它可能有助于后期处理。>
  3. 确保样品不会在图像之间的x或y平面漂移，以进行正确的后处理。>
  4. 精确的Z步（每个图像之间的距离）在样本中的范围很大。在每张图像之后，转动精细焦点，直到下一个平面对焦。在Kwan > 等> ，2019年，大多数图像每个Z-stack占用大约6-8张图像。>
  图2. Z-堆叠和聚焦堆叠的示例。在腹侧体（AE）上拍摄Z-堆叠后，通过聚焦堆叠（F）将每个图像的聚焦部分堆叠在一起。 br />
8. 移动到下一个未拍摄的区域，注意将连续的Z-堆叠重叠至少约20％，以确保照片拼接精度（图3）。
  
  图3. Z-stack的重叠对于正确的照片拼接是必要的。每个Z-堆叠（A，B）应该具有~20％的重叠区域以实现最佳的照片拼接（C）。 br />
9. 继续对Z-stack进行成像，直到拍摄完整个样本。
10. 拍摄显微镜标准，高度约等于样品厚度的一半。
  注意：只要显微镜的放大率没有变化且样品厚度相对相似，就可以在多个样品上应用相同的比例尺。>
聚焦和照片拼接
注意：>
1. 可以在youtube上找到解释焦点堆叠过程的视频教程 - > 使用Helicon快速入门重点> （由HeliconSoft发布）。>
2. 可以在youtube上找到解释照片拼接过程的视频教程 - > 如何拼接多个照片自动与Photoshop中的Photomerge一起> （由Photoshop Video Academy发布）。>
1. 将每堆图像导入Helicon Soft并渲染焦点堆叠。
  注意：>
  1. 从方法C（金字塔）开始。＆nbsp; >
  2. 如果图像边缘变形（光晕效果），则使用方法A（加权平均值）或方法B（深度图）进行故障排除 - 并增加“半径”值。在此处阅读有关不同方法的更多信息：> https：// www .heliconsoft.com /螺旋聚焦-主参数/ > >
  3. 可以使用其他焦点堆叠软件（> ，例如> ，Adobe Photoshop），但处理速度和结果质量可能会有所不同。>
2. 对每堆图像重复上述步骤。保存图像。
3. 在Adobe Photoshop中打开所有焦点堆叠图像并检查处理工件（图4）。如果存在工件，请使用“裁剪”工具（热键：C）丢弃工件。在继续之前保存所有更改。
  
  图4.在焦点堆叠期间创建的工件示例。可能会出现沿Z-stack边缘模糊区域的工件（黑色箭头），应该从图像中裁剪出来。
4. 在Adobe Photoshop中打开所有焦点堆叠图像并审查工件后，使用照片拼接工具（文件＆gt;自动化＆gt; Photomerge ...）。
5. 选择“添加打开文件”（所有文件必须已保存），选择“自动”，然后选择“确定”。
  注意：如果要拼接多个堆叠，此步骤可能需要一段时间。如果计算机崩溃，请尝试使用具有更多RAM和更强处理器的计算机。>＆nbsp;
6. 检查工件或未拍摄区域。保存图片。
7. 打开在步骤C10中取回的包含显微镜标准的图像。使用“矩形选框”工具（热键：M）测量已知宽度（例如>，1 mm）。＆nbsp;
8. 使用“画笔”工具（热键：B）填充矩形，其颜色与背景形成鲜明对比。
9. 选择彩色矩形后，复制（Windows热键：Ctrl + C; Mac热键：Cmd + C）比例尺并粘贴（Windows热键：Ctrl + V; Mac热键：Cmd + V）到照片拼接图像上样品。保存图片。
校准用于图像分析/离子细胞定量的测量工具
注意：可以在ImageJ中的Youtube-Set校准（由remotelab PloyU发布）中找到解释此过程的视频教程。>
1. 在FIJI / ImageJ中打开照片拼接图像。
2. 使用“放大镜”工具或按“+”键，放大比例尺。
  注意：在按“+”之前，将鼠标光标悬停在要放大的区域上。您也可以按“ - ”缩小。>
3. 使用“直线”工具，在比例尺保持移位上画一条线，将线锁定在90°角。＆nbsp;
4. 在窗口顶部（Mac屏幕），单击Analyze＆gt;设置比例。应该已经填充了像素的距离，因为这是您刚绘制的线条。填写“已知距离”和“长度单位”（例如>，1 mm），然后单击“确定”。
  注意：如果在多个样本中使用相同的比例尺，则选择“全局”旁边的框。这样，将在窗口（样本）之间记住像素与mm的比率。>
5. 为确保准确性，请打开先前在“步骤C10”中拍摄的显微镜标准图像。使用“直线”工具，在成像的比例尺上画一条线并测量（热键：M）。如果操作正确，成像比例尺和“测量”距离之间的差异应该可以忽略不计。
注意：从现在开始，该协议将样本视为鱼样本。其他样本可以进行类似的量化，但可能需要对该协议进行一些修改。>
表面积估计
1. 使用FIJI / ImageJ的“直线”工具，测量（热键：M）鱼幼虫的标准长度。记录这个值。
  注意：如果将鱼幼体固定或放置在弯曲位置，可以使用“分割线”工具（右键单击（Mac：命令+单击）“直线”工具）。>
2. 使用“徒手选择”工具，追踪鱼幼虫以测量（热键：M）其表面积。记录这个值。
  注意：如果使用鼠标进行徒手绘图很困难，请尝试使用平板电脑和手写笔。>
3. 使用“徒手选择”工具，跟踪离子细胞分布可能不同的感兴趣区域（在本例中我们使用头部，身体和鳍）和测量（热键：M）。记录这些值。
计数皮肤离子细胞
注意：>
1. 该技术适用于较小的鱼样本（<5 mm标准长度）和具有非均匀分布的离子细胞的样本。>
2. 解释此过程的视频教程可以在ImageJ的Youtube-Count项目中找到（由Timothy Spier出版）。>
1. 打开FIJI / ImageJ。
2. 如果使用ImageJ，请确保已安装“Cell Counter”插件（请参阅软件）。
3. 在FIJI / ImageJ中打开照片拼接图像。
4. 转到插件＆gt;分析＆gt; <细胞计数器>细胞计数器。
5. 在“细胞计数器”窗口中，单击“初始化”，选择“类型1”，然后在感兴趣的区域中放大（“+”）。＆nbsp;
6. 使用鼠标左键单击以表示该位置的单元格。计数器将在Cell Counter窗口的“Type 1”旁边更新。记录此值。
7. 要删除错误计数，请选中“删除模式”旁边的框。接下来，单击要删除的点。取消选中此框以继续计数。
8. 使用“单元格计数器”窗口中的“保存标记”选项可以保存您的工作。
估计皮肤离子细胞的数量
注意：该技术适用于具有均匀离子细胞分布的较大鱼类标本。由于离子细胞分布可能存在物种特异性变异，因此在使用之前，需要使用手动细胞计数（程序G）对该估算技术进行研究。>
1. 在Adobe Illustrator中使用比例尺打开照片拼接图像。
  注意：>
  1. 要放大，请使用缩放工具（热键：Z）并单击。>
  2. 要缩小，请使用缩放工具（热键：Z），按住ctrl（Mac：按住Cmd）并单击。>
2. 调整画板（热键：Shift + O）以适合照片拼接图像。如果照片拼接图像大于最大画板尺寸，则缩小图像尺寸1）单击图像，2）悬停在角落锚点上，3）按住“shift”，4）拖动以缩小图像尺寸。
3. 将此图层的名称更改为“图像”，然后将其锁定。创建四个附加图层并按此顺序排列：鳍数，体数，头数，网格，图像（从上到下）（图5）。
  注意：>
  1. 您可能还有其他感兴趣的领域需要额外的图层>
  2. 图层只有在1）可见，2）解锁和3）选中时才可编辑。>
  3. 顶部的图层将覆盖底部的图层。>
  图5.图层窗口中的关键按钮。眼睛符号（A）控制该图层的可见性，而锁定符号（B）控制该图层是否可编辑。要更改图层的名称，请双击名称（C）。要选择该图层中的所有内容，请单击感兴趣图层中的圆（D）。要添加其他图层，请单击“创建新图层”（E）。
4. 切换“标尺”选项（窗口：Ctrl + R; Mac：Cmd + R）。右键单击标尺并更改为“像素”。
5. 使用矩形工具（热键：M），在比例尺上拖动一个矩形（图6A）。
6. 在窗口顶部朝右侧的第二行，找到并单击橙色“变换”。＆nbsp;
7. 记录“W”旁边列出的值（图6B）。此值将帮助您在像素和测量的公制单位之间进行转换。
  
  图6.查找数字像素与测量公制单位之间的转换。在比例尺（A）上绘制一个矩形。然后矩形的宽度应出现在“变换”窗口（B）中。使用此值可在计算机像素和公制系统之间进行转换。
8. 使用在步骤F1中计算的标准长度，计算等于鱼样标准长度的2％的值。
9. 使用矩形工具，单击（不拖动）以创建具有自定义宽度和高度尺寸的形状。将“2％标准长度”值输入“宽度”和“高度”尺寸（制作正方形）。
  注意：例如，如果标本的标准长度= 8.80 mm，则标准长度的2％为0.176 mm。>
10. 复制并粘贴方块，直到网格覆盖整条鱼（图7）。
  注意：为了加快此过程，以下是一些有用的快捷方式：>
  1. 全选：“Windows：Ctrl + A，Mac：Cmd + A”>
  2. 复制：“Windows：Ctrl + C; Mac：Cmd + C“>
  3. 粘贴到位：“Windows：Ctrl + Shift + V; Mac：Cmd + Shift + V“>
  4. 在拖动新粘贴的单元格时，按住“Shift”键锁定X或Y平面中的方块。>
  5. 默认情况下，插图画家应“自动对齐”您的选择。如果关闭此功能，请转到偏好设置＆gt;选择和锚点显示并选中“对齐点”框。>
  图7.在照片缝合的黄鳍金枪鱼标本上覆盖网格的示例。每个方格的长度等于幼虫标准长度的2％。
11. 对网格的x和y轴进行编号。
12. 计算单个正方形的面积。记录这个值。
  注意：例如，如果标本的标准长度= 8.80 mm，则每个方格的面积为0.031 mm 2 。>
13. 使用步骤F2和F3中的测量值，计算需要计数的平方数，以覆盖每个感兴趣区域的10％（例如>，头部，身体，鳍）。记录覆盖每个区域至少10％所需的方格数。
  注意：>
  1. 如果头部区域面积= 4.9 mm 2 且每个正方形为0.031 mm > 2 > ，然后：> 。向上计算并计算16个方格，以充分覆盖至少10％的头部区域。>
  2. 不同体区的分离是必要的，因为区域离子细胞密度的变化可能由于物种特异性或发育阶段特异性差异而发生。>
14. 打开R.复制并粘贴提供的代码（参见下面的＃1 >）。在使用之前相应地调整X和Y坐标的数量。
  注意：下面使用此R的逐步说明：>
  ### Note＃1 >
  ###代码开头>
  ＃生成随机坐标>
  ＃Step-by-step instruction >
  ＃>
  ＃目标：这将随机生成500（x，y）坐标>
  ＃Step 1）在第15行中，将“59”替换为x轴上的方块数> ＃Step 2）在第16行中，将“17”替换为y轴上的方块数> ＃Step 3）突出显示所有内容（Windows：ctrl + A; Mac：cmd + A）>
  ＃Step 4）按住“Shift”并点击“enter”>
  ＃Step 5）在R Console窗口中查看输出。>
  ＃注1：某些坐标可能会重复;如果重复则跳过。>
  ＃注2：如果500（x，y）坐标不够，请重复，直到达到每个区域的配额。>
  
  x.coord = sample（1：59，replace = T，500）>
  y.coord = sample（1：17，replace = T，500）>
  rand.coords＆lt; - data.frame（x.coord，y.coord）>
  rand.coords >
  
  ###代码结束>
15. 对于每个随机生成的坐标，如果方块包含以下任何一项，则取消计数：
  1. 背景空间，眩光或其他摄影文物（图8A）。
  2. 折叠，内陷，颜料，防止准确计数（图8B）。
  3. 不止一个感兴趣的区域：头部，身体，鳍（图8C）。
    
    图8.不适合细胞计数的方块示例。随机生成的坐标不得包含以下特征：背景空间（A），折叠，内陷，颜料或其他暗区（B），以及空间包含多个区域例如>，包含正文和鳍（C）的框。
16. 如果方格符合上述标准，则标记为计数。
  注意：>
  1. 要快速指定计数方块，请使用“铅笔工具”（热键：N）来刻划标记。>
  2. 为避免意外移动网格或底层图像，请务必同时锁定网格和图像层（参见图5B）。>
17. 计算Adobe Illustrator中的单元格。对于每个区域，记录随机选择的网格方格中存在的离子细胞数量。
  注意：要快速记录方块中的单元格数，请使用“类型工具”（热键：T）并在方块内单击，然后键入计数单元格的数量。按“Esc”退出此模式。>
18. 如果网格线碰巧与免疫染色细胞重叠，则仅计数与正方形的顶部和右侧交叉的细胞。如果两个方格是彼此相邻的随机选择，这将确保不对细胞进行重复计算。
  注意：如果网格线太粗或单元格直接位于线条下方，请尝试选择网格图层（点击网格图层中最右边的圆圈;图5D）并将“笔触”值减小为“0.5” “或者将不透明度降低到50％以便更好地观看。>
19. 继续，直到每个区域（头部，身体，鳍）的至少10％被计算（图9）。
  
  图9.黄鳍金枪鱼标本和早期幼体皮肤离子细胞的定量方法（标准长度> 5 mm）。通过强烈的Na + / K鉴定离子细胞 + -ATPase免疫染色，并在头部（绿色），体（粉红色）和鳍（蓝色）区域内的重叠网格的随机取样框内计数。虚线白线勾勒出由于严重色素沉着而未采样的区域，从而阻止了精确的离子细胞计数。估计的离子细胞计数（15,342细胞）用手工离子细胞计数（无色区域; 14,795个细胞）进行研磨。该幼虫的估计相对离子细胞面积为3.75％。图来自Kwan 等人>，2019。
20. 使用以下等式计算估计值：
  
  ＆NBSP;注释：>
  1. 区域头部，身体或鳍 =头部，身体或鳍区域的测量区域（步骤F3）。>
  2. 离子细胞头部，身体或鳍 =每个区域计算的离子细胞总和（步骤H17）。>
  3. Square head，body或fins =每个区域计算的平方数（步骤H13）。>
  4. Area square =每个方块的大小=（标准长度* 0.02） 2 （步骤H12）。>
量化离子细胞大小
1. 打开ImageJ并设置比例尺，如过程E中所述。
2. 使用“徒手选择”工具，放大（热键：+）并跟踪单个皮肤离子细胞以估计它们的相对表面积。
  注意：如果徒手绘图很困难，请尝试使用平板电脑和手写笔。>
3. 重复步骤I2，直到您测量了来自不同感兴趣区域的20个细胞（例如>，头部，身体和鳍）。
4. 使用以下等式计算平均离子细胞大小：
  
  区域 head，body或fins 在步骤F3中计算。
  在步骤F2中计算面积 total 。
量化相对离子细胞面积

在步骤H20中计算估计的总离子细胞。
在步骤I4中计算平均离子细胞大小。
在步骤F2中计算总表面积。
方法控制和抗体验证
1. 非特异性二级和三级抗体结合对照：通过在步骤B6期间省略一级抗体（在4℃下在NHS封闭溶液中过夜）将几个鱼标本指定为阴性对照。与原代NKA抗体孵育的鱼标本应导致阳性染色（图10A）。相反，没有一抗的鱼样本应该导致没有染色（图10B）。
  注意：>
  1. 执行此阴性对照步骤是识别和避免目标生物体上存在的天然色素的好方法（步骤H15）。>
  2. 如果需要，可以重新培养和利用阴性对照鱼样品。只需重复所有程序B，重新免疫所述样品。>
  图10.免疫组织化学的阴性对照与（A）和没有（B）Na + / K + -ATPase（NKA）抗体。在顶部幼虫中看到的棕色沉淀物表示NKA存在于皮肤表面上，而在底部幼虫上没有褐色染色，成功地产生阴性对照。注意在估算过程中应避免在两个试样中含有天然色素的区域。
2. 通过蛋白质印迹的一抗抗体特异性：快速冷冻组织（-80°C）应与固定组织一起进行蛋白质印迹取样，这样可以产生一条接近目标蛋白质预测大小的单一条带（图11）。有关协议和其他详细信息，请参阅Kwan et al。>（2019）中的补充材料2。
  
  图11. Na + / K + <的Western印迹在黄鳍金枪鱼组织中用抗-NKA单克隆抗体进行Western印迹，得到单个~108 kDa的条带，与预测的蛋白质大小相匹配。 -ATPase（NKA）在黄鳍金枪鱼组织中的表达。图改编自Kwan 等人>，2019。

数据分析

离散细胞计数（步骤H20），平均离子细胞大小（步骤I4）和相对离子细胞面积（步骤J1）数据最好在散点图中描述并使用回归模型进行解释。在Kwan et al。>，2019年，我们使用线性回归检验了标准长度和孵化后天数的相对离子细胞面积的关系。线性回归的斜率解释了线的陡度，零假设为零，而R 2 描述了回归的拟合优度。可能适用的其他发展指标包括累积的热单位和样本的总长度。发展可能并不总是线性的;因此，研究人员应根据您的研究领域选择自己的回归。如果实验包括多种处理或物种，则应使用 t > - 测试（总共2次处理）或协方差分析（3次或更多次处理）来检查回归斜率的比较。有关其他详细信息，请参阅Zar（2014）。

食谱

1.2x磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（1L）
120毫升10倍PBS原液
880毫升去离子水
4％多聚甲醛（PFA）固定液（10 ml）
一个。在通风橱内打开PFA安瓿（20％储备溶液）
湾将2ml PFA储备溶液加入8ml 1.2x PBS溶液（配方1）中，在1M PBS中终浓度为4％PFA。反转混合
C。剩余的PFA储备溶液可以在4°C下储存长达六个月
d。 4％PFA固定液可在4°C下储存长达一周
3％过氧化氢溶液（10毫升）
1毫升30％的过氧化氢
9毫升自来水
1.0x PBS溶液（1升）
100毫升10倍PBS原液
900毫升去离子水
DAB底物工作液（与制造商说明相同）（~5 ml）
5毫升去离子水
2滴缓冲储备液（DAB底物试剂盒）
4滴DAB原液（DAB底物试剂盒）
2滴过氧化氢溶液（DAB基板试剂盒）
10％叠氮化钠原液（10毫升）
10毫升1.0倍PBS
1克叠氮化钠
0.02％叠氮化钠工作液（10毫升）
10毫升1.0倍PBS
20μl10％叠氮化钠储备溶液（配方6）

致谢

该方案对应于Kwan 等人>（2019）中提出的方法和实验。用于创建和优化该方案的幼虫黄鳍金枪鱼和白鲈鱼样品（ Atractoscion nobilis >）由美洲热带金枪鱼委员会（IATTC）和Hubbs海洋世界研究所（HSWRI）提供。我们感谢Jeanne Wexler（IATTC）对原始项目的贡献，以及对黄鳍金枪鱼幼虫的饲养和取样。我们感谢Diomedes Ballesteros，Lina Castillo，Susana Cusatti，Danisin Dominguez，Agustin Ortega，Daniel Perez，Dario Ramires，Daniel Solis，Luis Tejada和Carlos Vergara协助在巴拿马Achotines实验室生产和饲养黄鳍金枪鱼幼虫。我们感谢Daniel Margulies（IATTC）和Vernon Scholey（IATTC）开发黄鳍金枪鱼饲养方法，并监督Achotines实验室的产卵和幼虫饲养。我们感谢Erica Brombay-Fanning（HSWRI），Eric McIntire（HSWRI），Sabrina Sobel（HSWRI）和Christy Varga（HSWRI）对幼虫白鲈鱼的白鲈幼虫进行饲养和取样。我们感谢Mark Drawbridge（HSWRI）监督美国卡尔斯巴德Leon R. Raymond海洋鱼类孵化场的产卵和幼体饲养。作者要感谢Greg Rouse博士使用显微镜和相机设备，Sabine Faulhaber在扫描电子显微镜方面提供技术帮助，感谢Taylor Smith在解剖和成像方面的帮助。 G.T.K.得到了圣地亚哥奖学金和国家科学基金会研究生研究奖学金计划的支持。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

伦理

所有实验均经Scripps海洋研究所/加利福尼亚大学圣地亚哥动物护理委员会根据协议no。 S10320符合机构动物护理和使用委员会（IACUC）关于实验动物护理和使用的指南。

参考

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