材料和试剂

新鲜收集的肝素化血液
Ficoll Histopaque（Sigma-Aldrich，目录号：10771）
无菌PBS或Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（目录号：P-04-03590）
青霉素 - 链霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
（Qualigen，目录号：42425）
胎牛血清（Pan Biotech，目录号：1302-P100402）
台盼蓝（Mediatech，目录号：193）
补充有1％青霉素 - 链霉素溶液和10％FBS的DMEM（参见Recipes）

设备

带有旋出式铲斗转子（Eppendorf，目录号：5810 R）的离心机
肝素小瓶（BD Biosciences，目录号：367886）
无菌15ml离心管
自动移液器
200μl和1 ml提示
24孔细胞培养板（TPP Techno Plastic Products，目录号：20090123）
血细胞计数器
组织培养罩
CO <2>孵化器
显微镜

程序

在肝素化的小瓶中收集约4ml的人静脉血样品，并通过轻轻颠倒管子几次混合均匀。
通过使用Ficoll-Histophaque的梯度离心分离人PBMC
用10ml无菌DMEM（不含FBS）洗涤细胞（以100×g离心10分钟）两次。
注意：在建立培养物时，冷DMEM通常不用于从培养腔清洗淋巴细胞。相反，当需要收获单核细胞紧密地结合到塑料空腔时，可以使用预冷的DMEM。
弃去培养基并将细胞沉淀重悬在1ml无菌Dulbecco's改良的Eagle培养基中。
通过血细胞计数器使用W.B.C.计数细胞稀释液：将10μl细胞悬浮液加入到190μl的W.B.C.稀释液和混合好。加载细胞悬浮液在血细胞计数器和计数细胞。用补充有1％青霉素 - 链霉素溶液和10％FBS的Dulbecco改良的Eagle培养基调整细胞浓度为1×10 6个细胞/ml。来自4ml血液的细胞的近似产率在10 ^{-10 ⁸之间变化。}
在24孔培养板中接种500μl细胞悬浮液注意：当在37℃温育时，PBMC中的单核细胞在约2-3小时内附着到塑料上。更长的孵化将导致坚实的附件。淋巴细胞不是玻璃粘附的，并且它们将主要在悬浮液中，并且可以通过用培养基和/或缓冲液温和冲洗孔来除去。这种处理将使单核细胞牢固地附着于培养板的表面。
细胞可以用不同的抗原处理不同的时间段，并且可以分析上清液的细胞因子水平。可以分析细胞的表型变化，凋亡或增殖注意：PBMC是原代细胞，并且在正常条件下不能培养超过一次传代。可以使PBMC的淋巴细胞在体外通过有丝分裂原例如，植物血细胞凝集素或Concanavin-A 等一段时间到72-96小时。单核细胞通常是端细胞并且不增殖。在没有促细胞分裂剂的情况下，PBMC的增殖将是可忽略的

食谱

Dulbecco's改良的Eagle培养基，补充有1％的青霉素 - 链霉素溶液和10％FBS

技术说明

需要监测分离的PBMC的活力将200μl细胞悬浮液加入到200μl0.4％的台盼蓝溶液中并孵育15分钟。通过台盼蓝染色检查细胞的活力，并在显微镜下使用血球计（细胞吸收蓝色染色的细胞是死细胞）得分。
计算百分比生存力如下：
细胞活力=总活力细胞/总细胞×100
应该使用具有超过95％活力的细胞悬浮液进行培养。

致谢

实验室方案在高级作者实验室中使用1986年在Handbook of Experimental Immunology/edited by D.M.Weir中发表的模板随时间演变; 共同编辑，L. A. Herzenberg，Caroline Blackwell，Leonore A. Herzenberg。 Blackwell科学出版社。生命科学研究所由生物技术部资助，印度政府，SP得到印度医学研究委员会的奖学金资助。

参考文献

Panda，S.K.，Kumar，S.，Tupperwar，N.C.，Vaidya，T.，George，A.，Rath，S.，Bal，V.and Ravindran，B。（2012）。 Chitohexaose通过TLR4的交替途径激活巨噬细胞，阻断内毒素血症。 8（5）：e1002717。