材料和试剂

移液器吸头
15毫升离心管（Fisherbrand，目录号：07-200-886）
50毫升离心管（Fisherbrand，目录号：0553913）
组织培养板，24孔透明（Falcon，目录号：353047）
白色，96孔板，无菌白色盖子（PerkinElmer，目录号：6005181）
EDTA管紫色上衣用于采血：Vacutainer牌无菌（BD，目录号：366643）＆nbsp;
用于冷冻细胞的CryoTube TM 小瓶（Thermo Fischer Scientific，目录号：153779,202209,363401）
组织培养板，48孔透明（Falcon，目录号：353078）
5毫升圆底聚苯乙烯管（Corning，Falcon ®，目录号：352054）
TZM-bl细胞（NIH AIDS Reagent program，目录号：8129）
动物血清复合物（Gemini Bio Products，Fetal Plex TM ，目录号：100-602），在开瓶前储存于-18°C冰箱中，然后储存在4°C以备后续使用
DMSO（Life Technologies Corp，目录号：20688）
FBS（HyClone，目录号：SH3011803）
Beta-Glo分析系统（Promega，目录号：E4780），储存在-18°C冰箱中
定制有序的静息CD4 + T细胞阴性选择试剂盒（Stemcell Technologies，目录号：19309VK），带EasySep D磁性颗粒（Stemcell Technologies，目录号：19250），储存于4°C
Dynabeads TM 人类T-Activator CD3 / CD28（Thermo Fischer Scientific，Gibco TM ，目录号：11131D）
临床级人类重组白细胞介素-2：IL-2粉末22 MU VIAL（65483011607），储存在-18°C冰箱中，其中MU代表医疗单位
注意：或者，人重组IL-2可从Life Technologies Corp购买，目录号：PHC-0023。
人重组白细胞介素-7：IL-7 Premium级（Miltenyi Biotec，目录号：130-095-361），储存于-18°C冰箱中
Efaviranz（EFV）（Cayman Chemical，目录号：14412）需要重新悬浮在IMDM介质中并根据实验程序的需要进行稀释
流式单克隆抗体
注意：您将使用5μl的每种抗体进行染色。使用简单的Flow染色方法染色细胞。这样做是为了检查静息T细胞的纯度。静息T细胞是CD25- / CD69- / HLADR-细胞。
1. 小鼠抗人CD4-AF700（BD Biosciences，目录号：557922）
2. 小鼠抗人CD3-V450（BD Biosciences，目录号：560365）
3. 小鼠抗人CD25-APC（BD Biosciences，目录号：340939）
4. 小鼠抗人CD69-FITC（BD Biosciences，目录号：555530）
5. 小鼠抗人HLADR-PE（BD Biosciences，目录号：347367）
6. 小鼠抗人CD279-PeCy7（BD Biosciences，目录号：561272）＆nbsp;
注意：同种型对照的使用浓度与特异性抗体相同。因此，必须根据匹配抗体的浓度确定稀释度。
1. PE-Cy TM 7小鼠IgG ₁，κ同型对照（BD Biosciences，目录号：557646）
2. FITC小鼠IgG ₁，κ同型对照（BD Biosciences，目录号：556649）
3. V450小鼠IgG ₁，κ同型对照（BD Biosciences，目录号：561504）
4. Alexa Fluor ® 700小鼠IgG ₁，κ同型对照（BD Biosciences，目录号：557882）
5. APC-H7小鼠IgG ₁，κ同型对照（BD Biosciences，目录号：561427）
6. PE小鼠IgG _2a，κ同型对照（BD Biosciences，目录号：558595）＆nbsp;
Dye-eFluor 506（Invitrogen，目录号：65-0866-14）
DPBS（1x），Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（Corning Cellgro，目录号：21-031-CV），储存于4°C，开瓶后使用
干冰
HBSS（1x），Hanks平衡盐溶液（Thermo Fischer Scientific，Gibco TM ，目录号：141775-095），储存于4°C，用于开瓶后
IMDM（1x）（Thermo Fischer Scientific，Gibco TM ，目录号：12440-053），储存于4°C，开瓶后使用
淋巴细胞分离培养基（Corning，目录号：25-072-CV），储存于4℃，开瓶后使用
青霉素/链霉素（Thermo Fischer Scientific，Gibco TM ，目录号：15140-122），在开瓶前储存于-18°C冰箱，然后储存在4°C以备后续使用
含有L-谷氨酰胺和25 mM HEPES的RPMI 1640（1x）（Corning Cellgro，目录号：10-041-CV）
0.05％胰蛋白酶EDTA（1x）（Thermo Fischer Scientific，Gibco TM ，目录号：25300-120），在开瓶前储存在-20°C冰箱中，然后储存在4°C以备后续使用
RoboSep TM 缓冲液（Stemcell Technologies，目录号：20104）
福尔马林
10％RPMI（见食谱）
10％IMDM（见食谱）

注意：此程序可在BSL2 +实验室中按照安全程序进行，包括穿着封闭的实验室外套和双层手套。血液和处理都应该在生物安全罩中进行，并保持适当的气流。

设备

组织培养瓶通气帽，70 ml（Falcon，目录号：353109）
组织培养瓶通气帽，250 ml（Falcon，目录号：353110）
移液器
摇臂
培养箱（Thermo Electron Corporation，NAPCO SERIES 8000 WJ，CO ₂ Incubator）＆nbsp;
离心机：Sorvall Legend RT +离心机（Thermo Scientific）
冰箱
发光计（Promega GloMax Navigator，GM2000）
LN2冷冻柜
磁铁（干细胞技术，目录号：96290）
光学显微镜
4°C冰箱
流式细胞仪（BD，型号：LSR II）
水浴（Fisher Scientific，型号：2223）
血细胞计数器深度为0.100 mm（Hausser Scientific）

软件

FlowJo软件（Tree Star）
BD FACSDiva TM 软件（BD Biosciences）
IUPMStats v1.0感染频率计算器（在线） http://silicianolab.johnshopkins.edu/
Microsoft Excel

程序

注意：

为了获得足够的细胞以保持对实验组的控制相同，我们对HIV-1阴性供体以及该研究的参与者进行白细胞介导，并在-140°C下将这些细胞冷冻。
TZA协议可适用于新鲜和冷冻PBMC。

从患者和对照中分离rCD4 + T细胞
1. 从EDTA管的参与者收集血液。这通常由护士在医院完成，然后送去处理。＆nbsp;
2. 用DPBS稀释血液（1：2）。 40毫升管中的总体积应为10毫升血液，20毫升DPBS。＆nbsp;
3. 然后使用10ml淋巴细胞分离培养基或ficoll分离血液中的细胞层。这是通过将带有ficoll的移液管放在50ml管的底部并缓慢推入液体并在管的底部放置一层透明的ficoll来完成的。管中的液体总量不会达到50毫升。
4. 每种试剂在使用前都应处于室温下。＆nbsp;
5. 将其在离心机中以2,000rpm（448 x g ）旋转20分钟，以得到不同的PBMC层，其将出现在ficoll层与DPBS和血清混合物之间。 RBC将出现在试管的底部。＆nbsp;
6. 收集PBMC层并再次用离心机中的DPBS旋转以1,000rpm（112 x g ）洗涤10分钟。
7. 弃去上清液并收集沉淀（PBMC）。此时，您可以继续进行剩余的程序，或将细胞冷冻在冷冻培养基（FBS中的10％DMSO）中，并将其储存在-140°C下长期储存。＆nbsp;
8. 计数回收的细胞，然后使用静息CD4 + T细胞分离试剂盒从PBMC中分离出rCD4 + T细胞。由于此套件的产量不高，因此不要一次运行少于5000万个电池，这总是一个好主意。它是一种高纯度但低回收率的试剂盒。对于少于1亿个电池，也不要进行两次5分钟的分离，而是通过磁铁进行一次性分离。分离的详细信息列在与分离试剂盒一起发送的协议中。
9. 在继续下一步之前，再次计算细胞数。
注意：＆NBSP;
1. 你必须取出一些细胞并染色静息T细胞。这很重要，因为它可以帮助您确定所选细胞是否是纯静息T细胞。＆nbsp;
2. 如果我们正在使用rCD4 + T细胞，您可以预期大约500万到1500万rCD4 + 为患者解冻约1亿个PBMC的T细胞和约20-25百万个rCD4 + 来自1亿个正常对照PBMC的T细胞。无论新鲜细胞还是冷冻细胞，这都不会改变。
3. 为了解冻冷冻细胞，将冷冻细胞缓慢滴入，同时在含有10ml 10％IMDM的15ml管中以圆周运动移动管。然后以1,000 rpm（112 x g ）旋转细胞10分钟，将其从冷冻培养基中洗掉。
4. 对于来自阴性对照参与者的细胞，遵循相同的步骤A1-A9。对于每个实验，您都需要进行对照PBMC，并与其进行比较。
使用流式细胞术染色评估静息T细胞的纯度。（图1）
1. 首先，将细胞（2 x 10 5 至2.5 x 10 5 ）转移到试管中，并在4℃下以400 xg 离心5分钟分钟并去除上清液。＆nbsp;
2. 进行活力染色：用250μlDPBS和1μlViabilityDye-eFluor506重悬细胞沉淀。在4°C孵育30分钟。
3. 用DPBS洗涤细胞，并在4℃下以400μL离心平板5分钟并除去上清液。
4. 首先将细胞沉淀重悬于100μlDPBS中，然后将其置于5 ml圆底聚苯乙烯管中的抗体混合物中，材料和试剂中列出5μl每种抗体，并在4°C孵育30分钟。 ;
5. 将细胞在400℃下洗涤，在4℃下洗涤10分钟并除去上清液。这样做两次。
6. 将细胞固定在1％福尔马林中以运行流动。您可以在板材或管材中运行流动，但我们更喜欢管材。＆nbsp;
7. 关于单重群体和淋巴细胞的第一道门。通过对现场人口进行控制来实现这一目标。在活细胞群中，特异性地观察CD4 + / CD3 + 细胞，因为它们是T细胞。
8. 然后其余的门控来自CD4 + / CD3 + 细胞。为CD69，HLADR和CD25控制它们，它们都是激活标记。 PD1用于我们用于确定细胞死亡信号的门控，但如果您的后续实验不需要它，则使用它并不重要。
注意：您可以选择您选择的抗体作为激活标记，但我们使用CD-25，HLA-DR，CD-69作为激活标记。我们还使用PD1作为次要标记物，因为活化的细胞具有较低的PD1。您将寻找CD-25，HLA-DR，CD-69阴性的细胞。我们对CD4和CD3阳性细胞进行门控，因为我们正在寻找静息T细胞。如果对静息T细胞有益，则纯度为95％或更高。

图1.静息T细胞的纯度：静息T细胞应为CD25 / HLADR / CD69 - CD3 + / CD4 + 细胞。 A.对有效的单重群体进行门控，然后进入CD4 + / CD3 + 细胞。 B.对CD3 + / CD4 + 细胞进行门控以确定其活化状态（CD25 + / CD69 + / HLADR + ）。
静息T细胞的激活
1. 对于下一步，您需要首先刺激细胞进行激活。使用抗CD3 / CD28 Dynabeads，浓度为每百万个细胞中12.5μl珠子放入培养物中，它们将一起在培养物中培养6天，直到您进行下一个实验阶段。＆nbsp;
2. 在使用它们进行活化之前清洗珠子。将珠子放入5ml聚苯乙烯管中，放入RoboSep TM / EasySep TM 缓冲液（1ml）并放入磁铁中5分钟。然后在倾析液体后，将珠子重新悬浮在10％IMDM培养基中，与您取出的量完全重复。例如，如果您为800万个细胞取出100μl珠子，则清洗珠子，然后将其重悬于100μl10％IMDM培养基中，然后在最终激活混合物中将其重新吸出。（图2）。
3. 刺激培养物通常置于1.0百万细胞/ ml培养基中。 24孔板中的每个孔通常具有200万个静息T细胞，2ml 10％IMDM培养基和25μl重悬的抗CD3 / CD28 Dynabead。将细胞重新悬浮在含有珠子的培养基中后，每毫升培养基中加入300nm的EFV以防止细胞 - 细胞感染。始终根据细胞产量准备新鲜的。＆nbsp;
4. 为了获得最佳刺激，可以将细胞浓缩在较小的孔中（48孔板，在一个孔中具有1百万/ ml细胞），然后第二天转移到24孔板中。在24孔板中每孔培养2百万/ 2ml细胞（图2）。
5. 活化后24小时，加入10μl10 5 单位/ ml IL-2和10μl10 5 单位的IL-7百万细胞作为第二信号细胞因子维持细胞并帮助它们增殖。请勿卸下Anti-CD3 / CD28 Dynabeads。
6. 需要每天监测培养物，如果存在过度拥挤，通常当培养基变成非常黄的颜色并且每个孔中的细胞超过4百万个细胞时。在这种情况下，将更多的基础培养基放入孔中并将其分成两个孔。＆nbsp;
7. 分裂期间的基础培养基应始终含有IL-2，IL-7（第2天）和EFV以及10％IMDM。在培养基中添加培养基期间不需要珠子（图2）。
8. 这些细胞共培养6天（图2）。
  
  图2.处理潜在的细胞以进行激活
收获，接种和读取TZM-bl细胞的β-gal活性
1. 在培养的第5天（T细胞从培养物中取出前一天），种子96孔白色PerkinElmer平板，每孔5×10 5个细胞/孔，剩余培养皿3个总共64孔的TZM-bl细胞的x 10 4 细胞/孔。使用10％RPMI用于培养基，因为TZM-bl细胞在10％RPMI中生长。每个孔中的培养基总体积应为200μl。保持过夜，使细胞在第二天粘附在孔的底部。
  注意：不要将培养物中的TZM-bl细胞维持超过3周，并且每隔三天将细胞分开。分裂时，不要使用超过100万/ 10毫升的10％RPMI。 TZM-bl细胞在250ml通气的Falcon烧瓶中在10％RPMI中生长，并且在准备分裂时需要进行胰蛋白酶消化。当冷冻细胞培养开始时，确保在70毫升Falcon排气瓶中进行，然后随着时间的推移进行扩增。
2. 在培养开始的第6天，将活化的T细胞从24孔板中取出15ml锥形管，并以1,000rpm（112 xg ）离心10分钟以沉淀细胞。
  注意：如果您想比较这些激活的潜伏感染细胞的RNA产量，您可以保存RNA的上清液。这可以在-80°C冰箱中冷冻。您将不得不计算细胞并用DPBS洗涤两次。您还可以为每位患者节省50万个细胞用于DNA定量。为此，只需计数细胞，将它们放入Eppendorf管中，以1,000 rpm（112 x g ）旋转10分钟并沉淀细胞。然后直接将这些颗粒冷冻在-80°C冰箱中。如果您想计算针对特定参与者诱导的原病毒的比例，则使用此方法。
3. 使用其余的活化T细胞，开始进行稀释系列。从最高稀释度向下的1.25×10 5个细胞/孔开始进行4倍稀释（1：3）。（你可以从顶部开始低至6 x 10 4 细胞/孔）。
  注意：如果您从第一行中的1.25 x 10 5 单元格/井开始，则每行都在顶行（ 8孔）在200μl10％RPMI中应具有1.25×10 5 5 细胞/孔。第二行将在所有八个孔中具有1.25×10 5 / 4个细胞，依此类推，再进行五次稀释。这应该给你总共6个稀释液（图3）。
4. 在15ml管中制备稀释系列后，必须通过抽吸除去TZM-bl细胞板中的培养基，然后将患者细胞接种在其上。在开始研磨之前不要这样做，因为它会使盘中的细胞变干。通常不使用第七行，第八行是TZM-bl细胞上的新鲜培养基。（图3）。
5. 所有稀释液必须在10％RPMI中。
  
  图3.使用TZM-bl细胞在96孔中读取细胞
6. 将该板置于37°C培养箱中48小时，之后必须将其读取。这种读数可以在48到72小时之间的任何时间进行。
7. 取出平板，吸出培养基，不要打扰细胞。＆nbsp;
8. 用多通道移液器将DPBS放回孔中并轻轻洗涤并取出冲洗液并丢弃。这样做两次。洗涤时不要太严格，因为这可能会从板上取下细胞。
9. 每孔加入100μlPromegaBeta-Glo试剂，在黑暗中孵育45分钟-1小时。尝试在很少的光线下完成所有这些步骤。该试剂对光非常敏感。
10. 然后在Promega Glomax机器中读取以按照软件提示获取灯具。这是一台自动化机器，您必须选择任何细胞滴度协议，这些协议将能够读取您的平板。然后，您可以将板读取命名并保存为excel文件。
分析读数和IUPM计算
1. 读取后，将Excel文件传输出去以分析这些结果。首先，计算底部介质控制行的平均值（平均值），并从板中所有其他单个读数中减去该值。这将是你的空白。对于对照HIV-1阴性平板以及HIV-1阳性患者平板，应该这样做。这也可以确保您在测试和控制单元格中具有相似的条件。＆nbsp;
2. 在具有对照HIV-1阴性T细胞的对照板中，计算每行的平均值，每个稀释度的所有8个孔。每次稀释都要这样做。另外，计算每种稀释液的标准偏差。
3. 为每个稀释液添加标准偏差（平均值+ 2 SD）的平均值+ 2倍。这将为您提供对照孔中每种稀释度的值，您可以根据该值计算测试板中的阳性孔。
4. 在对照板中每个稀释度的值（平均值+ 2 SD）后，从参与者平板中特定稀释度的每个孔读数中减去它。
5. 这将为您提供一些具有正值且一些具有负值的井。正值可以在0/8到8/8之间变化。
6. 将这些读数放入Silicianos实验室开发的算法 http://silicianolab.johnshopkins.edu/ （Rosenbloom et al。，2005）并计算每百万细胞或IUPM的感染单位。＆nbsp;
7. 对于DNA拷贝/百万个细胞，使用标准DNA q-PCR（Cillo et al。，2014）在细胞中整合原病毒并计算可由刺激诱导形成的原病毒部分复制型病毒。用公式计算：fPVE = IUPM /每百万个细胞DNA×100。

数据分析

对于静息T细胞的纯度估计，使用FACSDiVa TM 软件在LSR II流式细胞仪上获得样品，然后将细胞置于培养物中用于活化。使用FlowJo分析流式细胞仪数据以对静息T细胞群进行门控，定量和分析。＆nbsp;
对于IUPM计算，应用最大似然估计来确定TZA测定的感染单位百万分率（IUPM）细胞，使用在线软件，可在 http://silicianolab.johnshopkins.edu/ ，由Rosenbloom 等人开发（2015）。

笔记

在整个方案中，您必须确保对另一组HIV-1阴性或对照细胞的细胞做同样的事情。如果您没有控件，那么您的实验将无效。您必须确保控制细胞甚至与患者细胞一样受到刺激，因此理想情况下您对测试细胞和对照细胞具有相似的条件。

食谱

10％RPMI
RPMI 1640
1x培养基，含10％动物血清复合物和1％青霉素 - 链霉素
在实验过程中保持无菌和室温，并在4°C下储存
10％IMDM
在-20°C下储存，混合450毫升IMDM w / L-谷氨酰胺与50毫升FBS和1％青霉素 - 链霉素（5毫升）
这将使IMDM的最终成交量达到10％FBS 应始终将其储存在4°C以便长期储存

致谢

该协议改编自我们的出版物（Sanyal et al。，2017）。我们感谢实验室前成员Lori Caruso，Deena Ratner和Ming Ding（匹兹堡匹兹堡大学）的技术援助; N. Sluis-Cremer用于DNA测量和研究设计输入; P. Tarwater（德克萨斯大学埃尔帕索分校）和C. Shen（匹兹堡匹兹堡大学）进行统计咨询和开发分析统计数据; W. Buchanan（匹兹堡匹兹堡大学）招募多中心艾滋病队列研究参与者进行研究;以及匹兹堡匹兹堡部分参与者为本研究献血的所有参与者。
＆NBSP;这项工作得到NIH资助R21AI138716（Phalguni Gupta），U01-AI35041（Charles R. Rinaldo。），R21-AI119117（Nicolas P. Sluis-Cremer和NIH Fogarty培训资助奖学金D43TW010039（Phalguni Gupta））的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

根据匹兹堡大学机构审查委员会批准的方案收集和处理血液，并由护士从医院中取出血液。 HIV-1阴性和阳性的参与者是从多中心艾滋病队列研究中招募的。
＆NBSP;所有参与者都获得了书面同意，并在继续进行之前以简单的方式向他们解释了研究。

参考

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Cillo，A.R.，Sobolewski，M.D.，Bosch，R.J.，Fyne，E.，Piatak，M.，Jr.，Coffin，J.M。和Mellors，J.W。（2014）。量化静息CD4 + T细胞中HIV-1潜伏期逆转抑制性抗逆转录病毒治疗的患者。 Proc Natl Acad Sci USA 111（19）：7078-7083。＆nbsp;
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