材料和试剂

在实验装置外的脑切片中PNN降解
1. Carbogen进针和出针（BD PrecisionGlide针，目录号：305198）
2. 灌注管（Becton Dickinson，PE-160，目录号：427431）
3. Carbogen鼓泡管（Fisher Scientific，Tygon，目录号：S3 E-3603）
4. 多通道分流器（Luner阀门分类，目录号：WPI-14055）
5. 转移移液器（Fisher品牌，目录号：13-711-7M）
6. 玻璃培养皿（Cole-Parmer仪器，目录号：EW-34551-06）
7. 聚苯乙烯泡沫（来自任何商业来源）
实验装置中脑切片中的PNN降解
1. 15毫升管（猎鹰，目录号：352097）
2. 薄灌注管（PVC泵管 - 1.52 mm内径，目录号：116-0549-19）
3. 鼓泡管（Fisher Scientific，Tygon，目录号：S3 E-3603）
4. 灌注管（Becton Dickinson，PE-160，目录号：427431）
PNN的结构完整性分析
1. 具有PV或NeuN的WFA的高放大倍率（40 x 5或更高）图像
脑切片的WFA染色
1. 24孔板（Falcon，目录号：35-3226）
2. 油漆刷（任何细尖的清洁刷）
3. 盖弗（Fisher Finest，目录号：12-548-5M）
4. 载玻片（微型载玻片，VWR，目录号：48311-703）
5. 安装介质（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：S36936）
6. 标记（实验室标记，VWR，目录号：52877-310）
7. 转移移液器（Fisher品牌，目录号：13711-7M）

的试剂

ChABC（Sigma-Aldrich，目录号：C3667-10U）
牛血清白蛋白（BSA）（西格玛奥德里奇，目录号：A8806-1G）
4％多聚甲醛（PFA）（电子显微镜科学，目录号：15714-S）
PBS（Fisher Bioreagent，目录号：BP661-10）
生物素化的紫藤Floribunda凝集素/凝集素（WFA / WFL）（Vector Laboratories，目录号：B-1355）
链霉抗生物素蛋白，Alexa Fluor TM 555 Conjugate（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：S32355）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐（DAPI）（Thermo Fisher，Life Tech，目录号：D1306）
安装介质（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：S36936）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
ChABC（见食谱）
PBS（见食谱）
4％PFA（见食谱）
ACSF（标准振铃器用于急性脑切片的ACSF）（Papouin和Haydon，2018，Tewari et al。，2018）（见食谱）
DAPI股票（见食谱）

设备

测量移液器（Gilson，目录号：F123602）
定时器（来自任何商业来源）
无菌空玻璃瓶，30毫升（如Hospire，目录号：5816-31）
切片孵育组件：如图2B-2D所示组装
浴缸加热器（Fisher Scientific，型号：Isotemp 205）
蠕动灌注泵（Gilson，型号：mini-plus 3）
直列式加热器（华纳仪器，目录号：TC324B）
高分辨率成像显微镜，如共聚焦显微镜（尼康元素）
95％O ₂ / 5％CO ₂罐（如AirGas）
-20°C冰柜（如Norlake）

软件

尼康NIS-Elements
尼康NIS-Elements AR分析
（可选）Clampfit（Molecular Devices）
（可选）Microsoft Excel / Origin（OriginLab）

程序

高放大率图像中PNN的结构完整性
1. 获得不同实验组中各个PNN的高倍率（40倍物镜，5倍数码变焦）多通道（带PV或NeuN）单平面荧光图像。图像应取自覆盖电池最大周长的光学平面。
2. 使用PNN（图1A和1B，大图像）绘制沿着细胞周边（用NeuN / PV染色）的手动/自动（取决于使用的软件）折线。
  1. 如果使用尼康元素程序，则使用自动ROI功能确定单元格的周长，然后绘制折线以及此周长。
  2. 如果使用斐济/ ImageJ，请使用手绘线工具沿单元格边界绘制一条线，然后单击“分析”，然后单击“绘图轮廓”按钮。
  3. 可以从峰轮廓图本身计算WFA峰值，也可以导出绘图轮廓的数值数据以绘制不同软件中的图形并计算峰值。
3. 在建立线轮廓后，软件生成线轮廓图，显示沿线的WFA荧光强度（图1A和1B，底部面板）。线轮廓图及其数值数据可以导出为Microsoft Excel文件，其长度（以μm为单位），荧光强度分别为x和y轴。可以从采集程序生成的图表中计算峰值（如图1A和1B所示，下图），或者可以在Excel /分析软件（如Sigma图或Origin）中绘制数据以进行峰值计数和表示。
4. 通过设置最大强度的一半的阈值来标记和计算线轮廓中的峰值数量（图1A-1B，下面板）。要确定PNN中最大孔的大小，请测量两个似乎彼此相距最远的连续峰之间的距离（图1A-1B中下方面板中的白色双头箭头）。（或者，在Clampfit结果窗口中绘制数据并将其保存为.atf文件。稍后打开此文件并使用峰值检测功能计算峰值数量。峰值检测功能的参数可以检测到很少的假峰值，这可以从分析中移除。此外，放置两个光阑覆盖间隙并记录它们之间的距离可用于确定最大孔的大小。）
  
  图1.在两个实验条件下分析PNN的WFA强度峰。 A和B.高倍率（40倍物镜，5倍数字变焦）WFA（绿色），PV（红色）的免疫组织化学染色图像并且覆盖（右侧的大图像）显示在神经胶质瘤相关性癫痫（A）的小鼠模型的大脑皮质中的单个PNN，以及相应的假对照（B）。沿着PV周边的折线（右）包括WFA染色并且显示由低WFA强度基线分开的离散WFA强度峰（由红色箭头标记）。白色虚线表示阈值（最大WFA强度/ 2）以确定WFA强度峰值。双头白色箭头显示两个连续WFA峰之间的最高视在距离，并指示PNN中最大孔的大小。峰的总数除以周长，以考虑不同大小的小区及其PNN。比例尺：5μm。
脑切片中PNNs的实验前降解
1. 根据标准脑切片方案准备脑切片，并在完成实验的恢复使用后（Papouin和Haydon，2018，Tewari et al。，2018）。
2. 使用两个玻璃瓶准备切片孵育组件;在每个盖子上做两个小孔，插入碳氢化合物气体供应的入口和出口针头。在针尖上插入适当长度的管子，使气体供应延伸到靠近缓冲液表面的位置。不要将这些气体管浸入溶液中（它可能会损坏切片）。
3. 通过将一个针入口连接到碳氢化合物供应管并使另一个针打开以作为出口（图2B）。
4. 接下来，在每个小瓶中填充3ml充分氧化的ACSF，并添加ChABC原液以在标记为处理的一个小瓶中制备0.5U / ml的ACSF的最终浓度。
5. 使用改进的移液管移动每个小瓶中的2-3个脑切片（切割移液管的尖端以扩大尖端以便于切片转移，如图2C所示）。
6. 从添加ChABC开始，将定时器设置为45分钟，并确保通过进样口的碳氢化合物气体供应正常。
7. 将两个小瓶放入定制的浮动聚苯乙烯泡沫（图2D）中，使小瓶在孵化期间漂浮在水浴中时保持笔直。
8. 将两个小瓶转移到水浴中，预设温度为32°C（图2E）。
9. 孵育45分钟后，小心取出小瓶，用ACSF冲洗切片，然后将切片从两个小瓶转移回回收室（图2G）。切片现在可以用于实验。
10. 完成实验后，小心地从实验装置中取出切片并用4％PFA固定过夜。如上所述，用WFA（和DAPI，如果需要）染色固定切片以确认ChABC的PNN降解效果。
  
  图2.使用实验前孵育方法对急性脑切片中的PNNs进行降解。 A.脑切片恢复室与ACSF中的皮质切片连续碳水化合物（95％O ₂，5％CO ₂）鼓泡。 B.用3ml ACSF（有/无ChABC）填充孵育小瓶（用于对照和ChABC处理的切片）并组装具有入口和一个出口的碳氢化合物气体供应管。 C.通过改良的移液管（培养皿上的B）从（A）向每个小瓶中加入2-3个脑切片，随后将小瓶插入聚苯乙烯泡沫中，使其在水浴（E）中保持平直，同时在32°温育C持续45分钟（F）。 G.孵育完成后，将切片在室温下转移回回收室进行实验。
在脑切片中的实时实验中PNN降解
1. 在记录设置中记录细胞/切片的基线活动5-10分钟（取决于具体实验）。
2. 将1U / ml ChABC溶液超融合50分钟，同时严格保持浴温在32-33℃（图3A）。
3. 记录50分钟后，再次灌注ACSF并在ACSF存在下记录活动5-10分钟（图3B）。＆nbsp;
4. 停止实验并将切片转移至24孔板并加入500μl，4％PFA以固定切片并在室温下保持过夜。
5. 如程序D所述，在第二天进行WFA染色。
  
  图3.实时数据采集过程中急性脑切片中PNNs的降解 A.含有连续碳氢化合物鼓泡的ChABC的ACSF被灌注并以2-3 ml / min的速度再循环至使用蠕动泵进行实验装置。 B.使用在线加热器进行记录设置，以保持浴温恒定在32°C。
固定急性脑切片中的WFA和DAPI染色
1. 用PBS冲洗切片4次，每次洗涤间隔5分钟。
2. 在每个切片中加入0.5ml含有生物素化-WFA溶液（PBS中1：300）的PBS，在室温下孵育1小时，然后每隔5分钟用PBS冲洗4次。
3. 在每个切片中加入含有链霉抗生物素蛋白缀合的Alexa fluor-555溶液（PBS中1：300）的0.5ml PBS，并在室温下孵育1小时，然后每隔5分钟用PBS漂洗4次。
4. 用含有DAPI的PBS（DMSO中10mg / ml原液1：1,000）孵育切片4分钟，每5分钟用PBS冲洗3次。
5. 将切片安装在2个盖玻片之间，允许用户访问切片的两个表面以进行成像。使用安装介质，不要用力按压盖玻片以防止组织变形。
6. 将安装的组织保持在载玻片上并拍摄记录的细胞/或脑区域的图像以确认PNN的降解。

数据分析

PNN的结构完整性
平均细胞的峰/单位周长数。使用＆gt;每只小鼠5个PNN和来自同一实验组的所有小鼠的池数据。比较不同实验组中的峰数，应用适当的统计检验并绘制图。平均来自同一实验组的所有小鼠的各个PNN和池数据中的最大间隙的长度。比较不同实验组的平均孔尺寸（间隙长度），应用适当的统计检验，并绘制图形。
确认实验PNN退化
使用荧光显微镜从切片的两侧拍摄图像。在实验前降解的情况下（程序B），切片的两个表面都没有显示任何完整的PNN。然而，放大的图像显示PNN表达细胞周围的WFA的微弱轮廓（图4B中的插图）。只有ACSF处理的切片显示完整的PNN（图4A）。在实验装置（程序C）中PNN降解的情况下，仅切片的顶部或暴露表面显示ChABC的降解作用（图4D）。高放大率图像（20x）显示PNN表达神经元周围的PNN的微弱轮廓（图4D中的插入图像）。在全细胞膜片钳实验的情况下，还可以将痕量染料添加到移液管缓冲液中以标记记录的细胞，并且在记录的细胞周围存在微弱的WFA轮廓表明细胞在ChABC处理之前表达PNN（Tewari et al。，2018）。

图4.孵育室和记录设置中ChABC处理急性切片后PNN降解的确认。 A和B.急性皮层切片的DAPI（上图）和WFA（中图）荧光的共聚焦图像在对照（A）和ChABC处理的（B）组的实验后固定后。叠加中的插入图像显示了PNN的受控降级的痕迹。 C和D.来自ChABC未暴露的底部表面（C）的DAPI（顶部）和WFA（中部）荧光的共聚焦图像，以及在实验中PNNs降解的急性脑切片的暴露于ChABC的顶部表面（D）与实验记录同时设置。与暴露表面（D）相比，未暴露表面（C）显示相对完整的PNN，其显示由于ChABC的直接暴露而降解的PNN。叠加中的插入图像来自切片中标记的矩形区域，并显示受控PNN降级的痕迹。比例尺：主图像为100μm，插入图像为10μm。

笔记

在程序B和C中，浴温对于维持在32-33°C以确保可靠的PNN降解至关重要。
在程序B中，孵育时间不应超过45分钟; PNN将完全降级，因此难以找到降级的PNN的痕迹。
在程序C中，建议将ChABC溶液再循环到记录装置中以最小化酶的量。
在程序C中，用于ChABC再循环的灌注管的总长度应保持最小，以减少时间滞后和总ChABC溶液的体积。
为了更精确地比较PNN降解时功能的变化，可以将脑切片切成分开大脑半球的两半，一半可以用ChABC处理，其他可以用作对照。
对于PNN在免疫组织化学（IHC）中的结构完整性分析，如果使用相同的软件分析所有实验组，也可以使用包括ImageJ / Fiji的可自由访问的软件。
用于PNNs结构完整性分析的高放大倍数图像应具有最小饱和度的荧光信号的整个范围，以最小化由于IHC程序引起的WFA强度的变化。

食谱

ChABC
1. 根据制造商的说明，在0.01％BSA水溶液中从普通变形虫中重建ChABC，制成1U /40μl储备液
2. 准备2U的等分试样并储存在-20°C直至使用
3. 在实验前，将适量添加到鼓泡ACSF中以达到工作浓度
PBS
将PBS盐混合物溶解在去离子水（DI）中以制备PBS溶液
4％PFA
将提供的32％PFA稀释至1（PFA）：7（PBS）以制备4％的工作溶液
ACSF
标准振铃器的缓冲液（125 NaCl，3 KCl，1.25 NaH ₂ PO ₄，25 NaHCO ₃，2 CaCl ₂，1.3 MgSO ₄，25葡萄糖（均为mM）; pH 7.3; 310±5 mOsm）用于急性切片记录（Tewari，Chaunsali et al。，2018 ）
DAPI股票
将DAPI溶解在DMSO中制成10 mg / ml的原液并储存在-20°C直至使用

致谢

这项工作得到NIHRO1-NS036692，NIH-RO1-NS082851和NIH-RO1-NS052634的支持。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益

伦理

所有动物程序均按照弗吉尼亚理工大学动物护理和使用委员会（IACUC）根据协议15-241（02/11 / 2016-02 / 09/2019），15-106（07）设定的伦理指南进行批准和执行。 / 31 / 2015-07 / 30/20188）和18-126（07/18 / 2018-07 / 15/2021）。

参考

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