材料和试剂

实验室耗材
1. 0.4μm孔径腈过滤器（Millipore，目录号：SLHA033SS）
2. 0.45μmPES过滤器单元（VWR，目录号：514-0335）
3. 显微镜载玻片（VWR，目录号：16004-422）
4. 显微镜盖板（VWR，目录号：48393-026）
5. 铝箔
6. 标记笔
管道
1. 1 x 25 m 5.5 mm内径柔性聚氨酯管（Legris，目录号：1025U0805）
2. 1 x硅胶管，25 m，2 mm（内径）x 4 mm（od），（VWR，目录号：228-0704）
3. 1 x硅胶管，4 m，4 mm（内径）x 6 mm（外径），（VWR，目录号：228-0709）
阀门和夹子
1. 8 x F-F¼'BSPP球阀（RS，RS Pro，目录号：733-5202）
2. 1 x ISMATEC 2停止编码管，标识：1.65 mm（蓝 - 蓝，目录号：SC0018），垫子：Tygon R-3607（Cole Parmer，目录号：EW-96460-38）
3. 2 x软管夹（VWR，目录号：21716-102）
连接器和配件
1. 1 x 8 mm-8 mm-8 mm Tee Legris（RS，目录号：445-4495）
2. 14 x Legris气动直螺纹到管适配器，R 1/4“公头，推入8 mm（RS，目录号：182-4784）
3. 3个SMC气动直螺纹到管适配器，Rc 1/8“母头，8英寸推入式（RS，目录号：771-5002）
4. 2个SMC气动弯头螺纹到管适配器，推入8 mm 1/4“螺纹（RS，目录号：771-6030）
5. 2 x Legris气动弯头螺纹转接件，R 1/4“公x R 1/4”公（RS，产品目录号：367-5792）
6. 2 x Legris Brass 1/4“in.BSPT公头螺纹接头（RS，目录号：231-5045）
7. 1个Legris气动三通螺纹管接头，1/4“。x 8 mm x 8 mm，30 bar（RS，目录号：225-0617）
8. 1个带倒钩的配件，直式连接器，天然PP，1/8“内径; 10 / pk（Cole-Parmer，目录号：EW-51518-05）
9. 带刺T形连接器，聚丙烯，1/8“; 25 / pk（Cole-Parmer，目录号：SI-50623-66）
10. 1 x ADCF公Luer至1/8“L倒钩适配器，聚丙烯，25 / pk（Cole-Parmer，目录号：SI-30800-24）
11. 1 x ADCF母鲁尔至1/8“L倒钩适配器，聚丙烯，25 / pk（Cole-Parmer，目录号：SI-30800-08）
饰品
1. 电工胶带，19 mm x 20m（RS，目录号：511-4306）
2. 插座延长线（RS，目录号：122-1105）
3. 1 x透明聚碳酸酯PC板，1.25 m x 610 mm x 6 mm（RS，目录号：681-665）
4. 1 x丁腈橡胶O形圈线，直径2 mm（RS，目录号：138-1600）
5. 1 x白色PTFE胶带12 mm x 12 m x 0.075 mm（RS，目录号：512-238）
6. 1 x盘头光亮镀锌钢机螺丝袋，M3,20 mm（RS，目录号：560-625）
7. 1 x不锈钢，六角螺母袋，M3（RS，目录号：189-563）
8. 1 x不锈钢平垫圈，0.5 mm厚度，M3（RS，目录号：189-620）
9. 1 x氰基丙烯酸酯胶（RS，目录号：533-478）
化学制品
1. 庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1077-1G）
2. 绝对乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：1009832500）
3. NaClO（VWR，目录号：470302-586）
4. 甘油85％（Sigma-Aldrich，目录号：1040942500）
5. Na ₂ HPO ₄·2H ₂ O（Sigma-Aldrich，目录号：71643-250G）
6. KH ₂ PO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：P5655-500G）
7. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S3014-1KG）
8. NH ₄ Cl（Sigma-Aldrich，目录号：A9434-500G）
9. MgSO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：M2643-500G）
10. 10x M9盐料（参见食谱）
11. 20％甘油（见食谱）
12. 1 M MgSO ₄（见食谱）
13. M9基本培养基补充0.2％（w / v）甘油（见食谱）

设备

2 x 2 L Pyrex ®窄口锥形瓶（Sigma-Aldrich，目录号：CLS49802L）
3 x 1 L Pyrex ®窄口锥形瓶（Sigma-Aldrich，目录号：CLS49801L）
1x Duran TM 4端口组装HPLC螺帽GL-45（Fisher Scientific，目录号：10740834）
1 x 1 L带螺帽的实验室瓶，DURAN ® GL-45（VWR，目录号：215-1517）
1 x 5 L BRAND ® PP烧杯，带有喷口，低压型（Sigma-Aldrich，目录号：BR87826-4EA）
1 x 16 mm长磁力搅拌棒（VWR，目录号：442-0366）
1 x 250 x 250 mm磁力搅拌器（VWR，目录号：444-0572）
轨道振动筛
1个流量计（奥尔堡P-150 mm，1/4“FNTP接头，目录号：P11A3-BB0）
2 x 12VDC泵（EKWD，EK-DCP 2.2，目录号：3831109862506）
3 x 220V AC / 12V DC适配器（RS Online，目录号：737-8149）
1 x 19-37.8升水族箱空气泵（Hagen，A842 Aquaclear Air pump 10，目录号：15561108447）
1 x Ismatec IPC-N ISM936D IPC-N（ISM936D）低速数字蠕动泵，带有Click-'-Go-Cartridge; 8通道，230V（Cole-Parmer，目录号：EW-78001-16）
1个可调节扳手（RS，目录号：469-7018）＆nbsp;
1台EMCO Concept Mill 105铣床
1x荧光显微镜，具有以下特点：
1. 光源和滤光片，可以观察GFP和德克萨斯红荧光染料
2. 带EMCCD芯片的单色数码相机（最低要求）
3. 电动托盘，用于自动XY位移和自动拼接扫描采集
4. 自动Z自动对焦

软件

科学编程语言（即，MATLAB）或通用编程语言（即，Python，C +）能够与支持基本统计功能的科学计算包一起使用（ ie ，均值，标准差），数组/结构操作（数组排序，长度）和元素选择运算符（唯一元素）
所选程序语言的图像处理库（即。，Python的scikit-image，MATLAB的图像处理工具箱）
包含适当库的图像处理软件（ImageJ或等效物），用于打开具有原生格式（即，*。lif）的显微镜文件，或能够执行常规格式文件存储的显微镜相关软件

程序

完整的实验可分为以下6个部分（A至F）。

流通池/生物膜室设计与制造
生物膜室的设计和制造涉及使用铣床产生图1中规定的几何形状。生物膜室几何形状的设计旨在促进通过可变雷诺数的矩形方形管道的层流，这是最后一个参数可通过设置入口处的流速进行调整。腔室的中心部分被分成具有适当水力直径的较小管道，以产生在通道内研究的流体动力学条件（Re~100-1,000的层流）。管道另外用作将位于不同位置的腔室的不同部分的技术复制品的方式。在输入和输出侧还添加了两个侧室，以便在进入通道之前对流体模式进行流体动力学稳定。
＆NBSP;然而，也可以使用其他方法来制造这种腔室。请阅读注1以获得更详细的解释。

图1.定制的生物膜室蓝图显示（A）侧视图，（B）前视图和（C）俯视图。根据该蓝图，使用铣床雕刻聚碳酸酯板。当前最先进的制造技术允许使用其他技术（如3D打印）在不同类型的材料中创建此设计或任何其他概念（ ie ，PP，PC，等。）与实验目的一致。尺寸以mm表示。
装配和设置流体回路
流体回路设计成在稳态状态和室温下工作，同时保持通过生物膜室的恒定流速。通过使用湿度室来增加进入空气流的相对湿度，可以最小化由于持续鼓泡引起的湿度损失。此外，在设计用于培养曝气（通过使用机械搅拌和鼓泡）和液体泵送（使用两个串联泵）的流体回路时应用冗余标准，以避免由于生长生物量而导致的氧气需求最终不足和水头损失增加。在电路表面内（即，管道，设备，等）。
1. 按照图2（上）所示的分布组织设备，同时考虑设备所在房间的可用空间。图2（下）示出了组装好的装置的斜视图和俯视图。通过这样做，您将意识到需要多少管来连接不同的元件以及如何放置不同的元件以便于所有组装，操作，检查和维护任务。
  
  图2.实验装置的示意图（上）和实际视图（下）。该系统由一个含有大量浮游细菌的培养皿组成，新鲜的养分和空气输入并使培养物通气，在稳定状态下工作的废物管线和将培养物输送到生物膜室的再循环管线。该再循环管线设计成允许大量液体培养物流过生物膜室而不消耗难以承受的量的营养培养基。
2. 带有阀门，流量计和流通池的螺旋管连接器，如图3所示，在外螺纹中使用PTFE带。在不破坏胶带的情况下牢固地拧紧螺纹。然后，切割所需长度的管件并按图示连接它们。
  
  图3.装配方案。使用协议中描述的不同组件，按照此方案组装设备。设备和容器按照字母数字编码（即，BR-1）进行标记，以帮助在元件级别提供有关如何在启动和操作期间操作设备的详细说明。
3. 组装定制O形圈以用于密封生物膜室盖：切割400 mm的2 mm丁腈橡胶O形环绳，并使用一滴氰基丙烯酸酯胶将两端连接起来。等待至少15分钟让胶完全干燥。
4. 用盖子盖住流动池/生物膜室并使用最合适的系统密封（更多细节见注3）。
5. 检查所有泵和空气压缩机是否按照回路中设计的流向连接，并标记生物膜室的流入和流出部件（即，盖上的标记用笔，贴纸， etc。）有一个参考并知道它内部流动的方向（因为腔室的几何对称性）。
6. 准备离心泵的电气连接。手动连接离心泵和AC / DC连接器。为此，请检查AC / DC转换器是否未连接到电网并切断电线的极端以使其空闲。分开正极和负极导线并剥离它们的极端，以便在AC / DC转换器和泵之间进行连接。将来自离心泵和转换器的相同极性的电线连接在一起，扭转它们。用电隔离胶带覆盖去皮部分。或者，如果用户具有压接工具（24AWG），则可以使用对接线接头连接器来连接电线。
7. 将所有电气设备连接到插座延长线。所有电线必须安全地放置在水接触之外，从而检查电线是否处于升高位置。使用任何可用的方法（胶带悬挂它们，升高的支撑将它们与水面分开）以避免在泄漏或意外溢出时与任何液体接触。
8. 建议执行泄漏测试以检测错误/不良/失败的连接：
  1. 首先关闭组装回路的所有阀门。
  2. 用蒸馏水填充2L Erlenmeyer烧瓶：这将用作整个实验的培养容器（在图3中标记为BR-1）。打开阀门V-1并通过手动填充蒸馏水灌注离心泵（P-1，P-2），将管道与培养容器（BR-1）连接，以尽可能多地吹扫空气。如果使用蠕动泵泵送水，则不需要最后一步。
  3. 以最大容量（如果有）和再循环管路（V-1，V-3，V-4，V-6）中的所有阀门打开流量计FM-1。打开泵P-1，P-2，检查液体是否完全充满电路。
  4. 让液体流动最少30分钟，并通过检查螺纹连接器中存在的小水滴或电路任何元件下方的水溢出，定期检查没有泄漏。如果检测到泄漏，请停止流动并首先尝试拧紧连接，干燥区域并重新启动流量以查看水是否仍然泄漏。如果泄漏仍然存在，请关闭电流，通过辅助管路2清洗水（参见图2）并卸下受影响的部件。如果损坏，请断开螺钉并更换PTFE胶带。添加额外的PTFE胶带层以在需要时增加隔离。
  5. 泄漏测试结束后，关闭阀门V-1，V-3，V-4和V-6，并手动清空培养皿。
最初的细菌培养和库存
1. 在实验开始前一天（第0天），接种50ml Erlenmeyer烧瓶，其中含有10ml补充有0.2％（w / v）甘油作为碳源的M9基本培养基和0.5μg/ ml庆大霉素。直接加入-80°C的 P冷冻甘油原液。 putida mt-2。
2. 在设定为170rpm的定轨振荡器中于30℃孵育过夜。
3. 在实验开始当天（第1天），测量培养物的OD ₆₀₀并将其稀释在1L新鲜M9 + 0.2％（w / v）甘油中以达到OD ₆₀₀ 0.0025。
4. 在启动装置之前，准备一个4 L的M9 + 0.2％（w / v）甘油补充了庆大霉素（0.5μg/ ml）的无菌原液。
启动
1. 在开始实验之前，必须对流体回路进行灭菌。为了做到这一点：
  1. 使用带刺倒刺的直连接器连接对应于营养/废物蠕动泵送管线PP-1的ISMATEC管道和2 mm硅胶管部件。还连接2毫米管线，空气将通过公鲁尔至1/8“L倒钩适配器将空气传导至主烧瓶。使用铝箔分别覆盖两个管线的极端，并对它们进行高压灭菌。
  2. 将500ml 1L Erlenmeyer烧瓶FL-3和700ml BR-1容器装入70％乙醇（v / v）中。在BR-1中引入磁力搅拌棒并将FL-3连接到辅助管线1.检查循环回路中的阀门V2，V-3，V-4和V-6是否打开，V-1和V-5是关闭，使流量计也以最大容量打开，并打开离心泵。将储存的乙醇在FL-3中转移至BR-1，直至大部分烧瓶为空，然后关闭泵P-1，P-2。这将用乙醇填充辅助管线1。关闭V-2并打开V-1。然后再次打开泵P-1和P-2，从而在60分钟内完成系统的灭菌。
  3. 停止离心泵P-1，P-2，打开阀门V-5，关闭V-6并打开P-1和P-2，让乙醇离开系统。必须通过让泵尽可能地清空培养容器BR-1来进行乙醇的去除。当泵仍然工作时，避免其全部空，因为这会在循环管路中引入空气并导致泵中的启动问题。＆nbsp;
  4. 一旦BR-1完全排空（并且没有空气仍然进入回路，如上所述），则断开P-1和P-2，并用1L无菌的另一个更换1L Erlenmeyer烧瓶FL-3。水。再次连接P-1，P-2，用大约100毫升的水清洗再循环管线中剩余的乙醇。关闭V-5并打开V-6让淡水进入主水箱并在1小时内清洗乙醇。
  5. 重复先前描述的乙醇 - 水替代操作，但使用1.2L新鲜M9培养基补充0.2％（w / v）甘油代替系统中的水，最后在BR-1中留下1L新鲜培养基。＆nbsp;
2. 此时将调整显微镜设置。为图像选择12位或16位分辨率，以获得更高的灰度值灵敏度。选择通道来检测研究菌株产生的荧光信号（这里我们推荐GFP，因为它的稳定性和性能）。取10μl饱和过夜培养物，用移液管尖端将其扩散到显微镜载玻片上。将盖玻片放在样品上并用显微镜检查。调整显微镜的增益和激光强度以获得非饱和图像。保持这些设置，因为它们将通过实验保持不变＆nbsp;
3. 关闭泵P-1，P-2和PP-1，关闭所有阀门，拆卸生物膜室BC-1并按照图像采集部分中详述的步骤将其放置在显微镜下。在生物膜室中收集图像（如果检测到任何信号，则它将由材料和/或液体介质自发荧光引起）。这些图像将用于设置背景噪声阈值。
4. 取下铝箔，用蠕动泵PP-1连接营养液FL-1和废液罐FL-2，用BR-1连接各自的输出。将管道放入烧瓶内时，避免管道与任何表面接触，以防止污染。将ISMATEC停止编码管放入泵盒中，检查它们是否正确固定。
5. 将4 mm硅胶管件连接到气泵的输出口。添加一个三通并在90°分支处连接一个带夹具CL-1的硅胶管，用于调节空气流入。然后将注射器过滤器的鲁尔侧连接到湿度箱HC-1。最后，通过在烧瓶中引入管的自由侧将HC-1的输出管与BR-1连接。有关其他注释，请参见注释2。
6. 以150rpm开启磁力搅拌器，并连接空气泵。使用夹具CL-1调节进入BR-1的空气流量，以避免形成过多的泡沫。
7. 以期望的目标流速连接蠕动泵。
系统的运作
1. 每天检查营养素库存是否为空。必要时在无菌环境中手动重新填充。＆nbsp;
2. 生物膜通过再循环管线（管道和设备）的内表面的扩散增加了要克服的流体动力学阻力，并且可能通过部分堵塞现象部分地产生瓶颈。尽管事实上流量计在实验开始时设定在所需的流速，但这可以在再循环管线中产生流速下降。每天检查流量计FM-1给出的流量值是实验选择的流量值，并根据需要进行调整。＆nbsp;
3. 查看由于连接松动而在操作过程中可能出现的任何泄漏。仔细检查接近关节的意外溢出物或液滴。如果有的话，停止泵并使用可调扳手拧紧接头。用乙醇70％（v / v）润湿泄漏，干燥并重新连接系统以检查问题是否已解决。
4. 实验结束后，如前所述，使用辅助管线1和2，用无菌水和次氯酸钠（10％[w / v]的NaClO）的混合物替换培养物。让系统将漂白剂再循环1小时以对再循环回路进行灭菌。清洗回路并在1小时内用蒸馏水重新加注，以清洗系统的漂白剂。
5. 拆卸回路，处理油管和生物膜腔，并存放备件和泵。
6. 对每个生物复制品和每个测试的实验条件重复所有先前的步骤。
图像采集过程
1. 在所需的时间，停止离心泵P-1，P-2和蠕动泵PP-1，关闭阀门V-1，V-6并打开阀门V-2，V-5。在无菌条件下，在500ml Erlenmeyer烧瓶中制备300ml新鲜M9培养基+ 0.2％（w / v）甘油，并将其连接到FL-3中。将FM-1的设定流量降低当前值的50％，然后打开离心泵P-1，P-2。这将用清洁的营养培养基清洗流动池室，减少浮游细菌在收集图像时产生的非特异性亮度。当引入400毫升液体时，关闭P-1，P-2，避免回路中的空气进入，并关闭阀门V-2，V-5。
2. 关闭阀门V-3和V-4并使用可调扳手将它们与电路断开。用70％（v / v）的乙醇填充烧杯并浸入两个弯头螺纹 - 管接头，以避免外部污染。如果在实验开始时将生物膜室放在显微镜上，请跳过此步骤。
3. 将生物膜室置于显微镜下，并通过观察其不规则性使用明场来定位材料的底部。如果腔室材料光滑透明，则可能难以聚焦样品底部（没有视觉参考来指导用户在哪里找到底部位置）：用记号笔在底部做一个小点在检查样品时，腔室的外表面创建视觉参考以跟随显微镜。
4. 可以通过挑选随机快照或通过合并通过n×m图像的规则网格空间分布的图像来执行合成图像（即，参见图4）。如果需要进行区域演化，请选择生物膜室的区域来收集它并用标记物进行识别。否则，在腔室中选择一个随机点。
5. 获取图像后，将生物膜室重新连接到其原始位置，检查室的方向是否与流动方向匹配，重置FL-1中的初始流速并重新连接设备以继续实验（适用时）。
  
  图4.显示定制室的一部分的平铺扫描图像。只有在合并一组形成规则网格的图片后，才能观察到设备的形状和定植它的整个生物膜图案覆盖整个通道的宽度。

数据分析

实验结束后，一组图像将被视为n×n矩阵，其中将对这些矩阵的每个元素执行减法，计数和平均操作。报告显微镜在特定空间位置捕获的GFP荧光相关强度值。因此，较大的强度值与每个像素中较大量的检测到的GFP直接相关。

＆NBSP;该程序首先处理每个图像以去除噪声并提取包含有关生物膜形态的信息的相关变量（参见图5），这将进一步用于收集定量统计参数以进行分析。这里描述了如何继续：

使用显微镜软件或任何其他图像软件（即，ImageJ），将图像保存为* .tiff文件。
使用所选的图像分析软件将* .tiff文件转换为灰度图像。
对于每组实验条件q，打开t = 0图像（）并计算图像中检测到的强度的平均值（”AVG“运算符），这将是生物膜室和营养培养基的背景信号。将结果舍入到最接近的整数（“round”运算符）以获得一个整数，以便在从强度曲线中折扣其效果时避免使用十进制数。
对于每个可用图像，执行以下循环：
1. 通过减去自动荧光值来消除样品的自发荧光贡献＆nbsp;（从t = 0样本计算）到图像的所有像素。
2. 在减法后为所有具有负值的像素指定值0。
3. 计算基础部分图像，定义为与处理后的图像大小相同的矩阵，其值均等于所有像素图像中登记的强度值的平均值（）。从概念上讲，它将是在图像中检测到的恒定值强度的一部分，其与腔室底部的均匀生物膜层的存在和GFP在生物膜细胞内的积累有关。是一个具有等于AVG的同质信号值的矩阵（）。
4. 过滤细胞内GFP积累产生的噪音值和生物膜孔内浮游细胞的存在。这里，可以根据用户的偏好应用不同的标准。在我们的例子中，噪声计算如下：
  
  其中，STD（）运算符计算。
5. 基底层信号和噪声贡献之间的差异将是覆盖图像的真实生物膜信号的估计（）。
6. 将所有负值降至零。
7. 现在，计算波动部分;＆nbsp; ，再次将所有负值降至零。

图5.灰度图像的滤波和形态数据提取。框图显示了提取相关形态参数的计算方案（＆nbsp;和＆nbsp; 变量）用于进一步的统计分析。

复制＆nbsp; 进入一个名为，其中将通过将小于所选阈值 th 的所有值降至零来创建二进制掩码，否则将值设置为1。选择等于1的阈值。
使用图像处理软件中包括的标记算法标记二进制图像中的连接像素，并使用类似于区域提取的算法计算在标签中检测到的每个连接区域的像素区域。请注意，此运算符的结果是包含对检测到的实体的不同度量的列表，然后需要选择“area”属性。有关其他信息，请参见注释。
仅通过对标记物体进行选择和计数来计算感兴趣的参数。这里评估了四个指标：生物膜层的平均强度（p1），平均簇大小（p2），簇占据的平均面积百分比（p3）和簇数（p4）。
其中 phys_ratio 是用于将正方形像素单位转换为μm 2 的因子，一旦在使用显微镜采集图像时选择了物镜和变焦，就会给出因子n 2 是图像中要覆盖的像素的最大可能区域（形成图像的像素总数），length（）运算符提供给定列表的元素数。
对于任何感兴趣的图片，以像素为单位计算聚类大小分布（）标记对象基于其占用区域。为此，请获取区域分布中出现的区域的唯一值（以像素为单位）（）和micron 2 （）然后遍历循环以计算具有这些区域值的已标记实体的数量。在此循环中，行位置存储在 elems 中，通过比较操作（步骤1）进行过滤，然后为＆nbsp;中的那些位置分配标签。＆nbsp;矩阵从＆nbsp;收集。此外，此类区域的元素数量存储在＆nbsp; （i）生成群集大小分布（步骤5）：

上述数据计算方案可应用于覆盖所有测试实验条件范围的整个图像数据集。对于每个测试的实验条件q，可以从分析每批图像（具有从不同生物复制品收集的k个图像）导出平均和标准偏差参数。结果，可以获得显示这些批次图像的平均值和误差条的条形图（参见图6A），以及尺寸和其他感兴趣的变量的分布曲线（参见图6B）。有关详细信息，请参阅Espeso等人的完整结果集。（2018）。
图6.执行数据分析步骤后获得的典型条形图（A）和分布曲线（B）

笔记

在制定该协议时，我们发现了与显微镜检查有关的几个问题。具体而言，使用配备有用于高显灵位移的检流盘的显微镜限制了在其上操作的最大重量。所描述的配置超出了这些参数，在安全阈值之外操作，这导致了几个稳定性问题。为避免显微镜损坏的任何风险，用户应考虑使用另一种方法来减轻生物膜腔的重量。我们建议用塑料阀门（PVC，PP）更换连接到流动室的铸铁阀门，通过使用柔性管道将生物膜腔室中的单独阀门更换，从而允许将阀门重量从测量托盘中移出或减小整个板材的尺寸以减少整体材料重量。此外，用户友好的3D打印技术的可用性提供了创建定制腔室的可能性，而无需使用工业铣床，如此处所使用的那样。使用防水材料（即，聚碳酸酯，聚丙烯）制造模型，使用有机蒸汽进一步处理以在微观水平密封材料孔（详见Tsuda等，2015），最后用两个相同材料的透明盖子覆盖它可能是一个很好的选择。
空气流量应辅助空气过滤器和辅助水箱入口之间的湿度箱，以避免干燥造成液体流失。要做到这一点，只需使用一个两个或四个入口GL-45盖子和一个装有500毫升高压灭菌水的普通1升烧瓶，允许进入的空气在进入系统之前通过水柱鼓泡。通过简单地将两片硅管连接到公母和鲁尔接头到1/8“L倒钩接头（将通过高压灭菌一起进行灭菌），将其连接到系统。
在小流通池的情况下，我们建议使用硅，但是对于流速较大的较大生物膜腔室，需要更强的固定（即，O形环与更大腔室的螺栓和螺母结合）。
这里提到的“regionprops”和“Label”操作符是在图像软件包（例如MATLAB或Python）中实现的函数，它们应用算法来标记被视为“连接”的图像中的检测区域，并测量感兴趣的典型参数（即，质心，时刻，等。）。根据所选的编程语言，调用这些函数和提供的输出可能会有所不同。这些函数使用的算法的详细信息可以在Haralick和Shapiro，1992; Jain等，1995; Fiorio和Gustedt，1996年;吴等人，2005年。

食谱

为了准备基本介质，请分别准备以下库存：

10x M9盐原料（500 ml溶液）
42.5 g Na ₂ HPO ₄·2H ₂ O
15克KH ₂ PO ₄
2.5克NaCl
5克NH ₄ Cl
500毫升H ₂ O.
甘油20％（w / v）（或任何其他所需碳源，100 ml）
23.53毫升85％（w / v）甘油
76.47ml H ₂ O.
1M MgSO 4 （对于100ml溶液）
12.03g MgSO 4
100毫升H ₂ O
高压灭菌并在室温下储存
M9基本培养基补充0.2％（w / v）甘油（1L）
100毫升M9盐10x
10毫升甘油20％（w / v）
2毫升MgSO 4 1 M
888ml无菌H ₂ O
注意：所有成分必须在无菌条件下混合（如果水先前已高压灭菌），或使用0.45μmPES过滤装置混合和过滤以避免污染。建议在需要时进行准备，以防止污染并尽量减少抗生素降解。

致谢

这项工作由西班牙经济和竞争力部BIO 2015-66960-C3-2-R（MINECO / FEDER）的HELIOS项目资助; ARISYS（ERC-2012-ADG-322797），EmPowerPutida（EU-H2020-BIOTEC-2014-2015-6335536），MADONNA（H2020-FET-OPEN-RIA-2017-1-766975），BioRoboost（H2020-NMBP-） BIO-CSA-2018）和SYNBIO4FLAV（H2020-NMBP / 0500）欧洲联盟和由马德里共和国（西班牙）和欧洲结构和投资基金资助的S2017 / BMD-3691 InGEMICS-CM合同。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考

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