材料和反应

1.5微腔管(WATSON，目录编号:131-7155C)
10吸μl管tip(华生,目录号:110-201C)
200吸μl管tip(华生,目录号:110-705C)
1000μl管tip(华生,目录:110-804C号)
96-well EIA/RIA plate (Corning，目录编号3590)
Absorbent paper(契约，目录编号:CB-09A)
免疫膜(Bio-Rad，目录编号:1620177)
拟南芥植物(Ecotype:哥伦比亚-0)
液体nitrogen
Distilled马桶
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) (Nacalai Tesque，目录编号35432 -21)
Sodium lauryl sulfa (SDS) (Nacalai Tesque，目录编号:31667 -65)
Glycerol (Nacalai Tesque，目录编号:17018-83)
保护inhibitor鸡尾酒平板电脑“完成”(Roche，目录编号:11836145001)
溴菲诺蓝(BPB) (Wako，目录编号:029-02912)
4-乙酰氨基-4 ' - maleimidylbenet - 2.2 ' -二磺酸(AMS)(邀请信，目录编号:A485)
Glycine (Nacalai Tesque，目录编号:17141-95)
氯化物钠(NaCl) (Nacalai Tesque，目录编号:31320-05)
Polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (Wako，目录编号:167-11515)
Methanol (Nacalai Tesque，目录编号:21914-74)
Pierce BCA protein assay kit(热科学，目录编号23225)
蛋白标记(e.g)， Bio-Rad，目录编号:161-0373)
ECL Prime阻滞剂(GE Healthcare，目录编号:RPN418V)
或ECL选择西方吸光度探测器(GE Healthcare，目录编号:RPN2232)或ECL选择西方吸光度探测器(GE Healthcare，目录编号:RPN2235)
保护利益的原始身体
第二种抗衰老的身体来保护你的利益
免疫反应增强(e.g.)，可以得到信号，Toyobo，目录编号:NKB-101)
蛋白质提取/thiol labeling solution(见模式)
sd - page电导缓冲区(见模式)
西部吸墨纸传输缓冲区
TTBS (eea模式)

设备

植物生长室(e.g.)， TOMY，模型:CFH-415)
10吸μl管(和。g。， P10, Gilson，目录编号:F144802)
20吸μl管(和。g。(， P20, Gilson，目录编号:F123600)
200吸μl管(和。g。， P200, Gilson，目录编号:F123601)
1000吸μl管(和。g。， P1000, Gilson，目录编号:F123602)
Mortar (AS ONE，目录编号:5-4054-01)
跺脚(AS ONE，目录编号:5-4055-01)
冷藏微离心机， TOMY，模型:MX-307)
加热块(e.g.)， TAITEC，模型:
iMark微板阅读器(Bio-Rad，目录编号:1681 - 130ja)
电力供应(e.g.)， act，模型AE-8135)
SDS-PAGE设备(e.g)， NIHON EIDO，模型NA-1012)
西部吸墨纸设备。，生物工艺，模型:BE-320)
照明图像分析器(e.g.)， Fujifilm, model: las4000 mini)

软件

图像处理和分析软件, ImageJ, < a href = " http://imagej.nih.gov/ij/ " target = " _blank”> http://imagej.nih.gov/ij// < / >)

程序

程序的视图如图1所示。< / br / > < / br / > <斯特朗> 1人物。测定蛋白酶状态的简单工作流程拟南芥

植物组织、蛋白质提取和thiol labeling的快速冷冻
1. 准备蛋白质提取/thiol labeling solution(见模式)。在黑暗的房间里保持温暖。
2. 将拟南芥植物置于预定的条件下(例如。，高光照条件)为预定的周期(例如:, 10分钟)。
3. 在取样前将液氮放入砂浆中。
4. 切除植物组织(例如:，叶子)，并立即将其浸泡在液氮的砂浆中。这一步应该在预期的条件下进行。我们通常使用两到三片完全展开的叶子，这些叶子是在长时间(16小时/8小时夜间)的条件下生长4周(新鲜重量为50-100毫克)。
5. 用杵研磨植物组织。小心地将粉末状植物组织移入微离心管。
6. 加入蛋白萃取/巯基标记液。对于我们的条件中描述的步骤A4,超过300μl解决方案的(3 - 6μl / mg叶片鲜重)应补充道。然后，在室温下放置1小时，使游离硫醇基团完全贴有AMS标签。AMS是一种与游离硫醇反应的马来酰亚胺试剂，但不与二硫键反应。
7. 加热蛋白质样品(例如。， 95℃，5min)。
8. 离心于20000 x g，室温10min。
9. 将上清液转移到一个新的微离心管中以去除碎片。
10. 使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒(根据制造商说明)测定蛋白浓度。在白蛋白标准中应加入等量的蛋白提取/硫醇标记液。在步骤A4-A6描述的条件下，大多数情况下蛋白浓度估计为4-6 mg/ml。< br / > 注:通常，蛋白样品在-30℃下稳定几个月。 < br / > < div风格= "空白:nowrap;} " > < br / > < / div >
SDS-PAGE和Western blotting
1. 制备用于SDS-PAGE的聚丙烯酰胺凝胶。我们通常使用85×60×1 mm的分离凝胶。注:丙烯酰胺的最佳浓度因蛋白而异。分子质量是一个关键的决定因素。例如,我们使用10%的丙烯酰胺凝胶检测ATP合酶CF <子> 1 - ? < /订阅>亚基(ca 35000)或特性,6-bisphosphatase (FBPase;和用于检测m型Trx的15%丙烯酰胺凝胶(约1.2万)(图2)。
2. 将聚丙烯酰胺凝胶置于电泳槽中。倒电泳缓冲液(见配方)。
3. 负载的蛋白质样品(相当于10-40μg蛋白质)的每个。运行电泳。< br / > 注意:最佳的样品装载量是可变的，这取决于感兴趣的蛋白质。SDS-PAGE的迁移时间对于更好地分离还原态和氧化态的蛋白质非常重要，这也取决于感兴趣的蛋白质。
4. 制备PVDF膜和吸湿纸用于Western blotting。PVDF膜必须先用甲醇亲水性处理(几秒钟)，然后再用转移缓冲液处理(几分钟);参见菜谱)使用前。
5. 将聚丙烯酰胺凝胶置于SDS-PAGE、PVDF膜、吸附剂纸后，置于吸湿设备上。运行印迹。
6. 吸光后，用蒸馏水冲洗PVDF膜，然后用TTBS(见配方)冲洗几分钟。
7. 将2% (w/v)阻断剂溶解于TTBS (e.g.)中，孵育PVDF膜。， 4℃过夜)。
8. 用TTBS稀释的一抗孵育PVDF膜。，室温2小时)。
9. 用TTBS ()冲洗PVDF膜。， 10min x 3次)。
10. 用TTBS稀释的二抗孵育PVDF膜。，室温1h)。
11. 用TTBS ()冲洗PVDF膜。， 10min x 3次)。
12. 用ECL原液孵育PVDF膜。检测发光。< br / > 注:免疫反应(步骤B6-B11)和信号检测(步骤B12)的最佳条件在很大程度上取决于感兴趣的蛋白。抗体的稀释率应仔细检查。如果信号较弱，使用免疫反应增强剂()可能会有帮助。，可以得到信号，Toyobo)或高灵敏度的检测试剂(e.g.)。， ECL Select, GE Healthcare).

数据分析

巯基标记马来酰亚胺试剂AMS的分子量为536.44，因此降低了SDS-PAGE上的蛋白迁移率。我们可以根据可观察到的带移来区分目标蛋白的氧化还原状态(图1)。如有必要，可通过对还原和氧化形式的信号强度进行量化(使用ImageJ等图像分析软件)来计算蛋白质的还原水平。
将该方法应用于从不断变化的环境条件(例如。， light)，我们可以追踪蛋白质在环境波动下的氧化还原行为(图2)。，吉田等。， 2018)。
本构表达的蛋白应作为负载控制进行分析。我们通常分析Rubisco大亚基。
除了二硫键的形成，一些蛋白质还经历另一种类型的氧化，包括硫酰化和亚硝基化。为了区分它们，我们需要其他的方法，如基于质谱的分析。< br / > < br / > 图2 。本实验揭示了蛋白质氧化还原动力学的例子。< / >强的结果三个叶绿体蛋白(ATP合酶CF <子> 1-γ< /订阅>亚基,特性,6-bisphosphatase (FBPase)和类型硫氧还蛋白(硫氧还蛋白- m 2))所示。将拟南芥植株置于强光(HL)至暗转(A)、暗转至HL转(B)、不同光照强度下15min (C)制备蛋白样品。我们之前的论文(A:吉田et al.， 2018;B:吉田和久堀，2018;C:吉田等人;2015)。详细的抽样条件见每一篇原始论文。< br / >

食谱

蛋白提取/硫醇标记液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8) 2% (w/v) SDS 7.5% (v/v)甘油 0.01% (w/v) BPB 4mm AMS 注意:AMS必须在使用之前添加。蛋白酶抑制剂鸡尾酒片“完整”也应添加。1片溶于2毫升蒸馏水中，蒸馏水可用作25x原液。
电泳缓冲液SDS-PAGE 25 mM Tris 0.1% (w/v) SDS 192毫米的甘氨酸
Western blotting转移缓冲液 25 mM Tris 192mm甘氨酸 20% (v / v)甲醇
ttb < br / > 20mm Tris-HCl (pH 7.5) 500mm NaCl 0.1% (v/v)聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯

致谢

该方案改编自吉田等人(2018)和我们的其他研究(见背景)。本研究由日本科学促进协会(JSPS) KAKENHI资助(资助编号:26840090至ky， 16H06556至K.Y.及T.H.)。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

参考文献

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