材料和试剂

材料＆NBSP;
1. 显微注射器（50μl）（中国高格）
动物
1. Sprague-Dawley白化大鼠（6周龄，150-180g），购自第四军医大学实验动物中心（FMMU）
  1. 在无特定病原体（SPF）的动物设施中共同饲养4-6只同性别的大鼠，湿度为40-60％，室温（RT）为22-26°C，持续2-3周抵达FMMU唐都医院后。
  2. 使大鼠保持12:12小时光照/黑暗循环（在20：00-08：00期间关灯）。
  3. 在libitum上提供水和食物。
试剂
1. 冻干的 Apis millifera 或蜂毒的全毒液[BV，项目编号：V3375，Merck Life Science（Shanghai）Co.，Ltd，中国]。
2. 福尔马林溶液（国药化学试剂有限公司，中国）
3. 0.4％BV解决方案（见食谱）
4. 2.5％福尔马林溶液（见食谱）

设备

摄像机（录像机，索尼，FDR-AX40，日本）
精确触觉感官评估器：von Frey单丝（Ugobasile，目录号：37450-275，Italy）
机械疼痛敏感性试验装置
机械疼痛敏感性测试设置（定制设备）包括支撑平台和用于限制动物移动范围的不透明塑料测试盒。支撑平台（160 x 30 x 40 cm）配有金属网。网状物的孔径（0.5cm×0.5cm）优选使得大鼠可以在表面上自由移动而不会被捕获。
塑料观察笼
另一个塑料观察笼底部覆盖着消毒木质填充物，可作为二元社交互动和交流的场地（40 x 30 x 15厘米，定制设备）。

软件

统计检验（SPSS 25.0）
图形和图形（GraphPad Software Inc.，California，USA，GraphPad Prism 7.0）

程序

准备实验
1. 每天，适应性测试在08:00至12:00之间进行（详见图1）。
  
  图1.预定实验设计的时间表
2. 在一个单独的房间内进行实验，远离不必要的气味，噪音或运动干扰。这个房间里没有其他动物可以看到。
3. 选择一对随机作为观察者（CO）或示范者（CD）的笼子，在同一实验之前共同安置两周以上的同性别同种。在住房期间，避免了任何类型的压力因素，如强烈的气味和噪音。＆nbsp;
4. 在第1-3天期间，让大鼠在实验前每天一次适应实验环境三天（图1）。
  注：实验环境的适应包括处理，放置，移除笼子到测试箱，录像机和观察室内安排的其他物体。（图2A-2D）
5. 在第3天，在引发二元社交相互作用（PDSI）之前测量所有动物的基线机械疼痛阈值（图2E-2F，表1）（也参见步骤B2）。 PDSI被定义为一种先发制人的条件，允许同伴之间的全身接触和社会交流，从而实现社会转移或痛苦的传染（Mogil，2015; Chen，2018）。
6. 在第4天，将VCR预先放置在观察笼的顶视图上，其中笼式（或非笼式）随机配对，分别作为疼痛的示范者和天真的观察者服务。
  
  图2.环境和操纵适应性和基线疼痛敏感性的测量。 A-D。适应实验环境和实验者手动处理。 E-F。使用一组von Frey单丝测量双侧后爪垫的缩爪机械阈值（PWMT）（另见视频1）。
  
  视频1.显示实验方案，用于建立实验动物疼痛模型的同理心。在第1-3天，环境和操纵适应实验环境和实验者手动处理。在第4天，首先使用一组von Frey单丝测量和测定幼稚CO大鼠的两只后爪中的PWMT的基线值，然后在幼稚CO和熟悉的同种（CD）之间进行30分钟PDSI的VCR。）在痛苦中（对于30分钟内的详细行为表达，PDSI也看到视频2，最后通过最后一次测量PWMT来确定是否在天然CO大鼠中发生了社会疼痛传染。
  
  表1.确定PWMT值的方法
  
  注：使用10级分级的von Frey单丝（vF），其重量范围为19.6 mN至588 mN（参见上表1）。 PWMT的测量从vF的最低强度开始到较高强度，并且以给定强度的端点读数停止，其可以诱导50-60％的爪缩回反射至施加到每个爪垫的10个刺激。表1显示了六只动物（＃1-6）中PWMT（PWMT baseline ，mN）基线值测量结果的一个例子。有关详细信息，当接受10次抚摸刺激（显示为0/10）时，动物＃1在强度为19.6 mN，39.2 mN，58.8 mN和78.4 mN的情况下对vF刺激没有反应，同时它以一只爪退缩作出反应到98.0 mNvF刺激的10倍（1/10），并且用爪子取出量为147 mN（3/10），并且用五爪和六爪取出量为255 mN（5/10）和294 mN（因此，PWMT baseline 值可以确定为255 mN（绿色矩形）。绿色矩形数字表示4只动物的爪垫（1-4 ＃）的读数PWMT，而红色矩形表示过敏的极端偏差（5 ＃）或低敏感性（6 ＃），应从实验中排除。
实验设计和程序
1. 启动二元社交互动（PDSI）
  1. 测试在每个实验日的08:00至14:00之间进行（详情参见图1）。事先将CO鼠放入试验笼中，使其自由移动30分钟。（图3A）
    
    图3. VCR安排的程序显示，CD大鼠中BV疼痛模型的准备以及疼痛中幼稚CO和CD之间的PDSI。 A. CO对VCR环境的适应性。 B-E.BV注射过程：用微量注射器（B）吸取50μlBV溶液。移除并引导CD鼠标头进入黑色帆布袋并露出左后爪（C-D）。然后，穿过皮肤穿过微量注射器的针头进入左后爪垫的中央部分，然后缓慢注射（D-E，箭头）。注射后立即取下针头并按压几秒钟以防止试剂外渗和出血（D-E，圆形）。 F-小时。将CD大鼠放回观察笼并用CO大鼠重新统一30分钟PDSI。（有关详细信息，请参阅视频1）
  2. 选择CD大鼠的疼痛模型：根据我们之前的研究，BV模型（Li et al。，2014和2018），福尔马林模型（Li et al。， 2018）和乙酸诱导的扭体模型（Lü et al。，2018）可以通过30分钟PDSI在CO大鼠中稳定地诱导共情反应。在这里，我们以BV模型为例。
  3. BV模型可以通过将BV溶液皮下（s.c.）注射到CD大鼠的左后爪垫中来产生。（图3B-3E）
    注意：大鼠用s.c.已经证明BV表达眼睛可识别的与疼痛相关的行为表现，例如持续的自发性爪子退缩，爪子舔和在注射的爪子上举起持续至少1小时。（Chen et al。，1999; Chen和Lariviere，2010; Li et al。，2014和2018 ;Lü 等。，2017）
  4. 在皮下注射后立即将CD大鼠放回测试笼中。 BV注射并允许PDSI持续30分钟。
  5. 启动VCR以记录30分钟PDSI期间的二元组行为。（图3F-3H，也见视频2）
  6. 分析CO的共情安慰行为（allo-licking和allo-grooming，见视频2），其他社交接近行为（allo-mouth sniffing和allo-tail sniffing），以及通过离线VCR进行自我梳理。记录CO中30分钟社交互动期间每种行为的计数和持续时间。
    注意：共情安慰行为包括异化和异化（图3G-3H）。判断移情安慰行为的标准：（1）异体舔被定义为观察者对示威者受伤部位的持续舔行动（本案例为左后爪）。舔不到1秒不计算在内。除了受伤的后爪外，舔指向身体的另一部分被排除在外。（2）异体修饰被定义为观察者与示威者的头部或身体的头部接触，伴随着有节奏的头部运动（也参见Burkett 等人， 2016; Li et al。，2018）。排除不到1秒的修饰。不包括针对生殖器或尾巴的修饰。
    
    视频2.在疼痛中同种（CD）的30分钟PDSI期间对幼稚CO的疼痛同情的行为表达。 Allo-licking和allo-grooming在痛苦中表现为幼稚CO对CD的安慰行为。
  7. 移除CO大鼠并将其运输到不透明的测试盒中进行PWMT测量，以评估移情机械性疼痛超敏反应（EMPH）。（方法见图2E-2F，表2）（步骤B2）
    
    表2.在疼痛的CD下30分钟PDSI后测量CO的PWMT
    
    注：弯曲力（255 mN，294 mN和392 mN，CO 1 1 ＃，2 ＃和3 ＃）在PDSI（BL，基线）之前能够引起50-60％爪退缩反射（表1中的绿色矩形数）变得更少（相同动物的78.4 mN，98.0 mN和78.4 mN，数字表示为表2中的绿色矩形，并且PWMT值的这种降低被定义为共情机械性疼痛超敏反应（EMPH）（参见Li 等，2014和2018; Lü et al。，2017）。在四只CO大鼠中，四分之一的患者在疼痛后CD中PDT后没有变化（参见动物4 ＃），这表明在某人身上看不到对疼痛的同情（见李 et al。，2018）。
2. PWMT的定量测量
  1. 将一个不透明的塑料测试盒（20 x 20 x 25 cm）预先放在支撑平台上，顶部有一个金属网（1 cm x 1 cm）。（图4A）
  2. 让CO鼠适应测试金属网平台30分钟。
  3. 如上所述，用渐变系列的von Frey单丝测量PWMT。（图2E-2F，图4B，也见表1的注释）
  4. 记录应用于刺激部位的相同vF单丝（10次刺激，5秒间隔）抚摸时的爪撤回反射次数，并增加vF单丝的刺激强度，直到弯曲力能够引出超过50 ％爪子撤回反射。（表2，也参见表1的注释，Chen et al。，1999）
  5. 按小时重复测量，直到PWMT恢复到PDSI之前的基线水平。（图4C）
    
    图4. PDSI后疼痛敏感度的定量测量。＆nbsp; A.将CO鼠标轻轻放在金属网平台上，避免惊吓。 B.测量30分钟PDSI后每小时间隔疼痛CD的PWMT变化。 C.与基线（BL）PWMT相比，30分钟PDSI后双侧PWMT减少5小时的时间过程（图4C来自Li 等。，2018。验证大鼠模型对痛苦的同情：社交伙伴中疼痛表达的影响。 Front Behav Neurosci ，12：242。根据CC BY许可开放获取期刊的许可）。

数据分析

所有统计分析均使用SPSS 25.0进行。该作品由GraphPad Prism 7.0创建。所有数据均显示为平均值±SEM。 PWMT的数据通过以下公式归一化：

PWMT = PWMT 后处理 / PWMT baselinex 100％

使用土耳其对多重比较进行校正的单因素方差分析来确定不同群体之间社会或非社会行为的统计显着性。单向重复测量ANOVA用于确定PWMT的统计显着性。

笔记

有关扩展模型和 http：// doi：10.3389 / fnbeh的预期结果示例，请参阅原始出版物。 2018.00242 。 CD的疼痛模型不限于BV模型。 CD中显示眼睛可识别的疼痛表现的其他疼痛模型可以在熟悉的CO同种中引起共情反应，例如福尔马林模型和乙酸诱导的扭体模型。然而，没有眼睛可识别的疼痛表现的疼痛模型可能无法在30分钟PDSI后熟悉的观察者中引起共情行为，例如完全弗氏佐剂（CFA）模型和备用神经损伤（SNI）模型（Li 等人，，2018）。
根据我们之前的实验，Sprague-Dawley大鼠或C57小鼠，无论是男性还是女性（未发表），都可以在对疼痛同情的研究中使用这些方案。
对于VCR设置，右上自上垂直视图优于任何方向，用于观察笼中主题动物的社交和非社交行为的离线评级。
以双盲方式执行离线VCR分析和机械疼痛敏感性测试。
在该实验中，观察者大鼠中机械性痛觉过敏的发生被认为是疼痛移情的重要指标，因此，严格要求基线机械疼痛阈值。但是，应排除一些PWMT小于147 mN或大于588 mN的极度过敏或过敏的大鼠（见表1和表2）。

食谱

0.4％BV解决方案
在使用前，通过将0.2mg BV溶于50μl的0.9％生理盐水（pH 7.4）中制备0.4％BV溶液
2.5％福尔马林溶液
使用前，将37％甲醛原液溶于0.9％生理盐水（pH 7.4）中，制备2.5％福尔马林溶液

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金委员会陈俊（81571072）和李春丽（31600855）的资助。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突或竞争利益。

伦理

本研究是根据ARRIVE指南（Kilkenny et al。，2010），1986年英国动物（科学程序）法案及相关指南，欧盟指令2010/63 /的建议进行的。欧盟动物实验，美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南（美国国立卫生研究院出版物第8023号，1978年修订），以及国际研究协会有意识动物实验性疼痛调查的伦理指南疼痛也得到严格遵守（Zimmermann，1983）。

参考

Burkett，J.P.，Andari，E.，Johnson，Z.V.，Curry，D.C.，de Waal，F.B。和Young，L.J。（2016）。啮齿动物依赖催产素的安慰行为。 Science 351 （6271）：375-378。
Chen，J。（2018）。对人类和啮齿动物的痛苦表示同情。 Neurosci Bull 34（1）：216-236。
Chen，J。和Lariviere，W。R.（2010）。蜂毒注射和治疗的伤害性和抗伤害感受效果：一把双刃剑。< / a> Prog Neurobiol 92（2）：151-183。
Chen，J.，Luo，C.，Li，H。和Chen，H。（1999）。在有意识地将皮下蜂毒注射到后爪足底表面后对机械和热刺激的原发性痛觉过敏大鼠：与福尔马林试验的比较研究。疼痛 83（1）：67-76。
达尔文，C。（1871）。人的血统。第2版。伦敦：企鹅集团。
de Waal，F。B. M.和Preston，S。D.（2017）。哺乳动物的同理心：行为表现和神经基础。 Nat Rev Neurosci 18（8）：498-509。
Godinho，F.，Faillenot，I.，Perchet，C.，Frot，M.，Magnin，M。和Garcia-Larrea，L。（2012）。其他人的痛苦如何增强我们的痛苦：寻找'指南痛觉过敏'的大脑相关性。 Eur J Pain 16：748-759。
Goubert，L.，Craig，K.D.，Vervoort，T.，Morley，S.，Sullivan，M.J。，de，C.W.A.C.，Cano，A。和Crombez，G。（2005）。面对痛苦中的其他人：同理心的影响。痛苦 118（3）：285-288。
Kilkenny，C.，Browne，W。J.，Cuthill，I.C。，Emerson，M。和Altman，D.G。（2010）。改进生物科学研究报告：报告动物研究的ARRIVE指南。 J Pharmacol Pharmacother 1（2）：94-99。
Lamm，C.，Decety，J。和Singer，T。（2011）。与直接经历的疼痛和对疼痛的同情相关的常见和独特神经网络的元分析证据。< / a> Neuroimage 54（3）：2492-2502。
Langford，D.J.，Crager，S.E.，Shehzad，Z.，Smith，S.B.，Sotocinal，S.G.，Levenstadt，J.S.，Chanda，M.L.，Levitin，D.J。和Mogil，J。S.（2006）。痛苦的社会调节作为对老鼠移情的证据。科学 312（5782）：1967-1970。
Li，CL，Yu，Y.，He，T.，Wang，RR，Geng，KW，Du，R.，Luo，WJ，Wei，N.，Wang，XL，Wang，Y.，Yang，Y.， Yu，YQ和Chen，J。（2018）。验证对疼痛的同情大鼠模型：社交伙伴中疼痛表现的影响。 Front Behav Neurosci 12：242。
Li，Z.，Lu，Y.F.，Li，C.L。，Wang，Y.，Sun，W.，He，T.，Chen，X.F.，Wang，X.L。和Chen，J。（2014）。与痛苦中的笼子的社交互动通过激活大鼠内侧前额叶皮层促进随后的脊髓伤害感受。疼痛 155（7）：1253-1261。
Loggia，M。L.，Mogil，J。S.和Bushnell，M。C.（2008）。移情伤害：对另一个人的同情会增加疼痛感知的感觉和情感成分。疼痛 136（1-2）：168-176。
Lü，Y.F.，Ren，B.，Ling，B.F.，Zhang，J.，Xu，C.and Li，Z。（2018）。与笼中心脏病患者的社交互动增加了整体摄入并诱导观察者大鼠的疼痛超敏反应。 Neurosci Lett 662：385-388。
Lü，Y.F.，Yang，Y.，Li，C.L。，Wang，Y.，Li，Z。和Chen，J。（2017）。蓝斑 - 去甲肾上腺素系统通过选择性上调背根中的P2X3受体介导对疼痛的同情大鼠神经节。前神经回路 11:66。
Martin，LJ，Hathaway，G.，Isbester，K.，Mirali，S.，Acland，EL，Niederstrasser，N.，Slepian，PM，Trost，Z.，Bartz，JA，Sapolsky，RM，Sternberg，WF，Levitin ，DJ和Mogil，JS（2015）。减少社会压力会引起小鼠和人类陌生人的痛苦情绪感染。 Curr Biol 25（3）：326-332。
Martin，L。J.，Tuttle，A.H。和Mogil，J.S。（2014）。人类和啮齿动物的疼痛与社会行为之间的相互作用。 Curr Top Behav Neurosci 20：233-250。
Mogil，J。S.（2015）。人类和啮齿动物的社会调节和疼痛。疼痛 156 Suppl 1：S35-41。
Panksepp，J。（1998）。情感神经科学：人类和动物的基础情感。牛津大学出版社。
Panksepp，J。和Panksepp，J.B。（2013）。建立对移情的跨物种理解。＆nbsp; Trends Neurosci 36（8）：489-496。
Panksepp，J。B.和Lahvis，G。P.（2011）。啮齿动物同情和情感神经科学。＆nbsp; Neurosci Biobehav Rev 35（9）：1864-1875。
Rainville，P.，Duncan，G.H.，Price，D.D.，Carrier，B。和Bushnell，M。C.（1997）。疼痛影响编码于人前扣带而不是躯体感觉皮层。科学 277（5328）：968-971。
Singer，T.，Seymour，B.，O'Doherty，J.，Kaube，H.，Dolan，R.J。和Frith，C.D。（2004）。对疼痛的同情涉及疼痛的情感但不是感觉成分。 Science 303（5661）：1157-1162。
Terbeck，S.，Savulescu，J.，Chesterman，L.P。和Cowen，P.J。（2016）。去甲肾上腺素对社会行为，群体间关系和道德决策的影响。 Neurosci Biobehav Rev 66：54-60。
Villemure，C。和Bushnell，M。C.（2009）。情绪影响脊柱外疼痛处理与注意力分开。 J Neurosci 29（3）：705-715。
Williams，A.E。和Rhudy，J.L。（2007）。条件性恐惧对人类疼痛阈值的影响：准备是否起作用？ J. Pain 8,598-606。 doi：10.1016 / j.jpain.2007.03.004。
Zimmermann，M。（1983）。有意识动物实验性疼痛调查的伦理指南。疼痛 16（2）：109-110。