材料和试剂

奶酪布（纯50级100％未漂白棉奶酪布应变，2码， www.amazon.com ）
培养皿（100 x 15 mm，Genesee Scientific，Olympus Plastics，目录号：32-107）
管道清洁剂（Creativity Street雪尼尔杆/管道清洁器12英寸x 6毫米，黑色来自 https://www.amazon.com < / A>）
睡眠管（TriKinetics Inc.，目录号：PPT5x65聚碳酸酯）
橡皮筋（Staples）
油漆刷（圆形尖头尼龙头发， www.amazon.com ）
飞管和插头（Genesee Scientific，目录号：32-116BF和49-102）
纸巾（Kimberly-Clark Kimtech Science Kimwipes，Amazon.com）
Drosophila （Bloomington Drosophila 资源中心， https://bdsc.indiana埃杜）
石蜡（来自 https://www.amazon.com 的Performa Unscented石蜡蜡珠）
蔗糖（西格玛，目录号：S8501）
琼脂糖（Sigma，目录号：A9539）
葡萄糖（Sigma，目录号：G8270-1KG）
酵母（Genesee Scientific，目录号：62-108）
Gelidium Agar（Genesee Scientific，目录号：66-105）
玉米面（Genesee Scientific，目录号：62-100）＆nbsp;
10％Tegosept（Genesee Scientific，目录号：20-258）
70％乙醇（西格玛，目录号：793213）
糖蜜（Genesee Scientific，目录号：62-118）
丙酸（Genesee Scientific，目录号：20-271）
（2-羟丙基）-β-环糊精（Sigma，目录号：H107）
Gabaxadol（THIP）（Sigma，目录号：T101）
飞食（参见葡萄糖和糖蜜媒介的食谱）
1. 飞行食物与糖蜜为生病的股票
2. 睡眠管的葡萄糖飞行食物

设备

温度计（Easy-Read ®温度计）（Sigma，目录号：Z425313）
搅拌棒（Fisher Scientific，目录号：14-513-83）
冰箱（Home Depot或三星购买）＆nbsp;
石蜡浴（来自 https://www.amazon.com 的Conair热石蜡浴真光）
Drosophila 活性监测器（Trikinetics）
孵化器（Percival，DR 36VL）
计算机（Mac或PC使用分箱和分析软件）
DAM延长电缆（SPLT5：5路分路器和CAB10：10“电缆，Trikinetics.com）
立体显微镜（Leica M80，Zeiss Stermi 2000，尼康SMZ745或任何标准立体镜）
光源（Dolan Jenner，KL300 LED或鹅颈）
CO 2 飞垫（Genesee Scientific，目录号：59-114）
CO 2 罐和调节器（Airgas）
Multi-tube Vortex（Troemner，目录号：945007/945008）

软件

DAMFileScan软件（TriKineticsDAMSystem）
MATLAB（MathWorks，Natick，MA）带有信号处理工具箱
棱镜（GraphPad）

程序

飞库存维修
在含有右旋糖培养基的标准飞行食品小瓶中，在12:12小时光照/黑暗循环下保持18℃和50％相对湿度（RH）的储备（参见Fly Food Recipe）。生病而没有产下足够卵的股票被转移到含有糖蜜的飞行培养基中（参见Fly Food Recipe）。翻转的股票每月至少一次飞到新鲜食物上。
用于睡眠检测的苍蝇收集
在立体显微镜下在CO 2 飞行垫上收集32只雄性果蝇并放入标准食物小瓶中。在睡眠测定之前，在相同的12:12小时光照/黑暗循环和50％RH下将收集的果蝇保持在21-25℃，持续至少两天。
1. 处女和交配的雌性果蝇睡眠方式不同，为了防止雌性果蝇在管中产卵，我们只测试处女雌性果蝇。然而，这种差异可以根据基因型和遗传背景而变化。一些研究还使用含有5％蔗糖和1％琼脂糖的睡眠管，因为它可以防止产卵。
2. 使用年龄匹配且在羽化后3-7天内进行睡眠检测的成年果蝇。
睡眠管的制备
1. 在装载试验的前一天，制作睡眠管以确保食物具有适当的水分和硬度，以进行3-7天的睡眠记录（参见食谱）。在32个睡眠管的束周围缠上橡皮筋;每个DAM被加载需要一个捆绑（可以提前完成，参见图1A）。虽然苍蝇媒介仍然很热，但每个培养皿倒入约100毫升。立即将成束的睡眠管直立放入睡眠食物中，使得束独立地站立，使管的开口端浸没。管的浸没部分将填充飞蝇介质，其将在实验期间用作食物和水源。确保管子没有倾斜，因为这会导致食物水平不均匀。每个培养皿最多可装7个捆。用干酪包布覆盖干燥睡眠管束。
2. 当管中的培养基在室温下固化（约30分钟）时，取下粗棉布并小心地从睡眠食品中取出睡眠管束，确保每个管中都留有琼脂糖塞。取下橡皮筋，用纸巾清洁睡眠管两侧的介质。将每个睡眠管的含食物末端浸入石蜡中两到三次，以完全涂覆这一端。没有必要等待蘸料之间的蜡干燥，但是在所有浸渍后约5秒钟允许蜡固化。如果蜡从末端滴落而食物暴露，再次浸泡直至食物完全被覆盖。将蜡管置于纸巾上，在室温下干燥。
  注意：将干燥的蜡管放入冰箱中，用湿纸巾密封容器中，以保持湿度。存放超过一天的管可能会变干并无法使用。
3. 在使用前至少2小时从冰箱中取出管子，以确保内部没有冷凝水，并在装载苍蝇之前让它们平衡到室温。
  
  图1.在活动监测器中准备和加载睡眠管。 A.睡眠管（5英寸x 65毫米）用于装载食物/所需营养基质。 B.在显示器上装有苍蝇的睡眠管。 C.通过培养箱中的2或10“电缆连接到电源单元和计算机的监视器。 D.食物填充管，一端带石蜡密封，另一端带管道清洁剂。
加载活动监视器
1. 将管道清洁器切成约0.5厘米长，每个玻璃管使用一件。
2. 将收集的苍蝇放在CO 2 垫上，并用油漆刷将一只苍蝇放入上蜡睡眠管的开口端。在内部飞行时，用一个管道清洁器盖住打开的非打蜡末端。将装好的管子放在一边，直到装满32根管子。
3. 将睡眠管首先放入显示器的最右侧和最左侧的列（参见图1B）。将每个管子推入监视器的孔中，使得管道清洁器端部比打蜡端部突出得更多。
4. 在顶部两排管周围放置一根橡皮筋（见图1B）。对底部两行执行相同操作。
5. 将剩余的管交替放置在橡皮筋的上方和下方，使它们紧密贴合并且不会自由移动（见图1A-1D）。
6. 装入所有管子后，对齐所有管子，使管子的中心位于DAM的中心。通过将装载的DAM按压到平坦的表面（如桌面）上，管道清洁器一侧向下，直到所有管的中心与显示器的中心对齐，从而对齐管道。注意，这是在步骤D3中管道在管道清洁器方向上被进一步推动的原因。
7. 在用睡眠管加载所有DAM后，将DAM置于设定为50％RH的21℃培养箱中并且在所需的12:12小时光照/黑暗循环中将果蝇先前夹带。
8. 在计算机上打开DAM软件并进入监视范围。虽然您最多可以加载120个显示器，但不建议用于睡眠实验，因为必须每分钟进行一次活动读数，并且加载超过40个显示器会延迟读取并导致睡眠测量中的错误。
9. 将显示器插入电源单元，该电源单元插入记录监控数据的计算机，如（Chiu 等人，2010）所述。
10. 确保插入的监视器编号在第一次通过时显示为黄色，然后在DAMFileScan软件自动扫描时显示为绿色。
11. 让培养箱不受干扰，直到试验结束，如果需要，可以改变温度。对于温度敏感突变，如dTRP和Shibire（Kitamoto，2001; Hamada et al。，2008），第1天的温度通常为21°C，9℃时温度升至29°C ：第2天上午30点（点亮），第3天上午9:30降至21°C。典型的恒温实验在21°C或25°C的培养箱中持续5天。

数据分析

表示为IR光束的遮挡的运动数据被输出为具有日期和时间戳信息的.txt文件。每个原始监视器数据文件有32个通道，每个通道代表一个睡眠管/飞行，必须转换为单通道文件，作为1分钟和30分钟的分档进行睡眠分析。

保存并存储数据
1. 打开DAMFileScanData文件夹并选择要分析的监视器编号（单击第一个监视器，然后按住shift并单击最后一个以选择全部）。将这些文件复制到根据实验命名的新文件夹。
2. 打开DAMFileScan，然后单击“选择输入数据文件夹”。选择在步骤A1中创建的数据文件夹（参见图2）。
3. 从使用的最低到最高监视器编号中选择“监视范围”。
4. 将“输出文件类型”设置为“通道文件”，并将“额外读数”设置为“汇总到箱子”。
5. 根据整个测定过程中的日夜灯光计划选择箱子范围和长度。首先选择1分钟的Bin长度。在“First Bin to Save”下，选择孵化器灯开启后一分钟，在正确的试用开始日期（例如，如果灯在09:30:00开启，第一个1分钟的垃圾箱将是09:31:00）。在Last Bin to Save下，选择试用最后一天灯开启的时间（例如，09：30：00）。
6. 为试验中包含的第一天命名分箱文件。例如，如果第1天是2017年7月21日，则该文件将命名为072117.单击“保存”。
7. 根据第一个试用日命名的文件夹将显示保存原始监视器文件的位置。立即重命名此文件夹，在末尾包含“_1”（例如，072117_1）。＆nbsp;
8. 重复步骤3-5为Bin Length选择30分钟。示例屏幕如图2所示。
  
  图2.在1分钟装箱期间的DAM文件扫描屏幕。示例性实验从2017年7月21日到2017年7月25日。
使用MATLAB消除死亡或不动的苍蝇的通道
1. 启动MATLAB，输入“scamp”并按Enter键。 SCAMP计划可在此处获得 https://www.trikinetics.com/ ，并首次发布于（Donelson 等人，2012）。
2. 选择包含一分钟分档的文件夹（例如，072118_1），然后单击“选择文件夹”。
3. 选择包含三十分钟分档的文件夹（例如，072118_30），然后单击“选择文件夹”。
4. “选择板”页面将打开已加载的显示器列表（图3）。
  
  图3.“选择电路板”屏幕进行分类。示例实验使用监视器1-18（左侧列出）。
分类后的睡眠数据分析
1. 选择第一个监视器并单击“LOAD Individual Sleep Plots”以查看试验期间每个苍蝇的活动。该屏幕显示将用于消除未来睡眠分析中死亡或不动的苍蝇。在整个试验期间确保每只苍蝇都活着（观察到束断裂）。没有光束断裂的纯蓝色表示苍蝇已经死亡。有关试验期间死亡的苍蝇的示例图，请参见图4。
2. 记录从分析中排除的每个苍蝇的通道号（图4）。
3. 对所有其他监视器重复步骤。
4. 导航到“选择板”屏幕（图3）并取消选中要从给定监视器中排除的每个通道左侧的框。
5. 在每个监视器的每个框中输入基因型的名称，即“组”。这可以通过仅输入一次基因型，用Control + C复制，然后在点击“Tab”之间交替持续控制来快速完成。和“V”粘贴。
6. 当所有监测器都已根据死亡和活苍蝇进行分类并以适当的基因型命名时，请选择所有监测器以深入分析睡眠特征。
7. 单击“Individual Sleep Plots”按钮下方的“Analyze select data”（参见图3）。
8. 将打开一个新屏幕 - 选择“图表数据？”和“导出数据？”。点击“分析所选垃圾箱。”＆nbsp;
9. 选择所需的日期，然后单击第二个按钮，“AVERAGE GRAPH和EXPORT”。
  
  图4.示例分类屏幕。在上述实验中，排除了通道12,13,17和25。通道编号按从左到右的数字顺序排列：顶行包含通道1-8;第二行包含通道9-16;第三行包含频道17-24;底行包含25-32频道。
  
  如果试验有温度变化：
  1. 仅选择第1天，然后单击“AVERAGE GRAPH和EXPORT”按钮。
  2. Excel文件将开始填充到保存1分钟和30分钟分档的文件夹中。等待屏幕打开，显示数据的摘要初步图表。
  3. 将所有Excel文件移动到名为Day 1 Baseline的新文件夹。
  4. 对于每个后续日重复步骤a和b，在新文件夹中相应地命名它们（例如，第2天可以是抑制或激活，以及第3天恢复）。
  如果试验没有温度变化：
  1. 确保选择所有日期，然后单击“AVERAGE GRAPH AND EXPORT”按钮。
  2. Excel文件将开始填充到保存1分钟和30分钟分档的文件夹中。等待屏幕打开，显示数据的摘要初步图表。
  3. 将所有Excel文件移动到标题为“平均数据”的新文件夹。
在Prism或任何其他图形或统计程序中执行数据分析
图5显示使用GraphPad Prism绘制使用12小时光照和12小时黑暗条件的总睡眠（24小时），白天和夜间睡眠的代表性数据。
1. 在Prism中打开一个新文件，并为睡眠数据分析创建一个新的XY项目，以绘制和执行不同睡眠参数的统计分析。
2. 创建总睡眠图。
  1. 对于温度变化实验，打开电子表格，查看在Microsoft Excel中12小时光照和12小时黑暗条件下2-3天夹带后的实验日。总睡眠，白天和夜间睡眠保存在以“-stdur”结尾的Excel文件中。
  2. 从Excel文件列A中标记适当的基因型名称（参见图5）。
  3. 对于每种基因型，垂直复制并粘贴来自24小时箱（将在Excel文件中的D列中显示）的数据，以便数据将出现在A组下的A组的Prism中。
  4. 输入所有苍蝇的数据并排除计算的平均值和SEM。
  5. 对每种基因型重复数据分析B和C.
  6. 单击Graphs / Data 1图表生成图形（参见图5）。
  7. 在“更改图表类型”下，选择“列”。
  8. 在“Plot”下，选择Mean with SEM，然后单击OK。
  9. 重命名轴（对于例如，X轴是基因型，Y轴是总睡眠，以分钟为单位）并选择位于“分析”工具栏右下方的“魔术”工具（以蓝色圈出）图6）并选择任何其他图表以使它们彼此一致。
3. 创建个体睡眠图：睡眠曲线显示24小时内睡眠/ 30分钟。
  1. 打开以“-s30”结尾的Excel文档。在Excel新工作表中将Excel表格中的相应基因型名称键入A组。复制第一个基因型的平均值和SEM数据，然后右键单击选择“粘贴转置”。这会将水平框垂直粘贴到Prism文档中的A组。
    
    图5. Prism屏幕（右）和相应的Excel工作表（左）显示活动监视器中的基因型信息和苍蝇编号（1-32）
  2. 单击上述步骤3a中的数据表的相应图表。在“Graph Family”的下拉列表中选择“Grouped”（参见图6的下拉列表，当前选择“Column”）。将图形系列下方的条一直向右滑动，然后选择显示的第二个图形，其中包含一个散点图，它们之间有线条。确保为“Plot”选择“Mean with SEM”。单击“确定”。（图6）
4. 创建延迟图：指示从关灯到第一次睡眠开始（ZT 12）的开始时间。
  1. 打开以“-latency”结尾的Excel文档。为Total Sleep Plots创建一个新的Prism工作表，并在Prism中列出基因类型组，因为它们列在Excel的A列中。＆nbsp;
  2. 从Excel中的“2 nd 12 h bin”复制数据（确保不包括在B列中标记为“Average”和“SEM”的那些点）并将它们粘贴到相应的组中在棱镜中。对所有基因型重复上述步骤。
  3. 在数据分析D中重复2e-2f以生成延迟图。
5. 创建OA平均图：指示的光束数/唤醒分钟数。
  1. 打开以“-oamean”结尾的Excel文档。创建一个新的Prism工作表，并在Prism中命名基因类型组，因为它们列在Excel工作表的A列中。
  2. 复制并粘贴Excel文档中“24 h bin”的数据（确保不包括B列中标记为“Average”和“SEM”的那些点）并将它们粘贴到Prism中相应的Group中。
  3. 生成图2e-2f（在数据分析D下）。 OA平均值是一个重要的指标，因为它表明苍蝇在清醒时的活动而不是静止。一般来说，大量睡眠的苍蝇表现出高OA意味着平衡休息和活动。
    
    图6. Prism Graph布局屏幕
6. 创建布特数字图：表示夜间睡眠比赛的次数。
  1. 打开以“-sfreq”结尾的Excel文档。创建一个新的Prism工作表，并在Prism中命名基因类型组，因为它们列在Excel工作表的A列中。
  2. 复制并粘贴Excel文档中“2 nd 12 h bin”的数据（确保不包括B列中标记为“Average”和“SEM”的那些点）并粘贴它们进入相应的棱镜组。
  3. 生成图2e-2f（在数据分析D下）。高回合数字表示睡眠碎片。
7. 创建平均布特长度图：每个睡眠回合的指示平均长度。
  1. 打开以“-smeandur”结尾的Excel文档。创建一个新的Prism工作表，并在Prism中命名基因类型组，因为它们列在Excel工作表的A列中。
  2. 复制并粘贴Excel文档中“2 nd 12 h bin”的数据（确保不包括B列中标记为“Average”和“SEM”的那些点）并粘贴它们进入相应的棱镜组。
  3. 生成图2e-2f中的图形。较短的睡眠发作通常与较多的发作相对应，并且表明睡眠高度分散。
示例数据
根据数据结构执行统计分析。上述步骤提取了睡眠量和结构的特征，可用于了解特定的遗传，行为和药理学操作如何影响睡眠。图7提供了示出上述不同睡眠参数的示例图。

图7.睡眠图显示睡眠数量和质量的不同特征。 A.表达RNAi的两个不同神经元子集（MBON 1和MBON 2）的睡眠概况（Bloomington Drosophila 资源中心65997）沉默多巴胺受体Dop1R2的表达。 B.两种实验基因型的总睡眠时间（分钟）。光盘。两种基因型在几分钟内的白天和夜晚睡眠。 E.步行活动（光束休息/分钟）。 F. ZT（Zeitgeber时间）之后苍蝇开始第一次睡眠的时间/时间，其中ZT 12指的是关灯。 G-小时。睡眠发作次数和测试基因型的平均发作长度是睡眠碎片的指标。通过非参数测试（未配对）Mann-Whitney检验比较两种基因型。使用双尾 P 值来确定显着性（*** P <0.0001和** P <0.001）。 />
睡眠操作
虽然操作特定神经元的遗传方法通常用于果蝇来研究睡眠的神经调节，但人们越来越关注用操纵睡眠驱动来测量苍蝇的神经反应（Kayser et al。，2015; Beckwith et al。，2017; Chen et al。，2017; Machado et al。，2017）。除了测量神经元对睡眠操作的反应之外，最近的研究还显示睡眠剥夺后关键基因的表达增加（Toda et al。，2019）。
在这里，我们描述了使用机械和药理学方法增加或减少睡眠驱动的方法。
1. 机械剥夺：这种方法需要间歇性摇动监视器，以DAM采集程序设定的随机间隔移动苍蝇。如上所述，可以通过在睡眠监测器中剥夺期间测量睡眠来评估睡眠剥夺。加载监视器后，DAM监视器中的苍蝇被放置在水平涡旋器上。涡旋式电源线连接到光控制器（LC4），该控制器对设备的电源进行编程，以提供可使用DAM采集软件设置的脉冲。可以控制脉冲长度和频率。我们在整个晚上每分钟使用20-30秒的震动，脉冲持续2,3,3,2秒。设置为Rn设置，表示正态分布后的随机应用程序。脉冲，重复周期和分布的时间可以设置为随机正常，随机均匀和空白/无随机设置，以增加或减少剥夺水平（图8显示产生机械脉冲的振动器设置的示例屏幕截图）足以在野生型CS蝇中诱导睡眠剥夺。通常被剥夺16小时的苍蝇表现出强烈的睡眠反弹。对于不同的基因型和遗传背景，剥夺水平（与基线睡眠相比在剥夺期间失去的睡眠）和反弹（剥夺后的睡眠恢复）是可变的。
2. 药理学治疗：或者，可以通过喂食苍蝇药物来诱导睡眠或诱导睡眠。当冷却至50-60℃时，将卡马西平（CBZ）以0.8mg / ml的浓度添加到用于睡眠管的熔融食物中。可以将蓝色或红色染料添加到食物中以确保苍蝇摄取药物。如（Agosto等人，，2008）所述，将CBZ制备成溶解于45％（2-羟丙基）-β-环糊精中的储备溶液（20mg / ml）。 CBZ以依赖于遗传操作和遗传背景的方式影响白天和夜间睡眠。如Dissel et al。，2015所述，通过用0.1 mg / ml加沙他多（THIP）处理果蝇可以实现夜间睡眠诱导。
  
  图8.使用Troemner涡旋器控制机械脉冲的DAM系统软件的示例屏幕截图。涡旋器直接连接到与软件接口的光控制器，以控制脉冲的开启时间，持续时间脉冲和重复周期。
3. 遗传剥夺：如（Donlea et al。，2017）所述，几种神经元与诱导唤醒和觉醒有关。通过dTrpA1的错误表达，夜间激活多巴胺系统神经元子集（由广泛的多巴胺驱动子标记，如Th-Gal4或更多靶向驱动因子，如图9中所示的54B-Gal4）和章鱼胺系统神经元（由Tdc2-Gal4靶向），温度门控的非特异性阳离子通道，当温度从21到30-30°C升高时，诱导增加的觉醒（Kume et al。，2005; Crocker和Sehgal，2008; Seidner 等人，，2015，Sitaraman et al。，2015a或2015b ??）。与机械剥夺不同，我们发现当温度降至21°C时，这些神经元的激活并不总是导致剥夺后的睡眠反弹。
  
  图9.表达dTrpA1的蝇的睡眠特征，这是由MB054B标记的PAM多巴胺神经元中的温度敏感离子通道（灰色）。对照苍蝇（紫色）与没有dTrpA1表达的MB054B转基因显示没有剥夺温度从21°C（蓝色条）升至28°C（红色条）。＆nbsp;

食谱

用糖蜜飞行食物（1.5升）
105克玉米粉
44克酵母
12克琼脂
100毫升糖蜜
1.4升自来水
在70％乙醇中加入16毫升10％Tegosept
注意：加热并搅拌除Tegosept外的所有成分的混合物，直至混合物达到90°C。从热源中取出并冷却20分钟。在70％乙醇中加入10％Tegosept，搅拌，再冷却40分钟。倒入苍蝇管，盖上干酪包布，晾干过夜。用泡沫塞盖住食物并存放在冰箱中。
睡眠管的葡萄糖飞食（1升）
48克玉米粉
8克琼脂
25克酵母
100克右旋糖（D-葡萄糖）
在70％乙醇中加入16毫升10％Tegosept
1.8毫升丙酸
注意：去除一些水以保湿玉米面和酵母。加入葡萄糖和琼脂。打开热量，煮沸。加入玉米面 - 酵母混合物并再煮沸15-20分钟。关闭热量，并在食物凉爽时加入Tegosept和丙酸。

致谢

这项工作得到了NI的Grant＃1R15GM125073-01的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

参考

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