材料和试剂

P1000提示（VWR，目录号：GREI740280_60）
15毫升猎鹰管（EuroClone，目录号：ET5050B）
培养皿100毫米（EuroClone，目录号：ET2100）
Cryovials（康宁，目录号：430659）
E 15.5小鼠胚胎（Charles River，C57BL / 6 Mouse，Strain Code：027）
胎牛血清欧盟批准（FBS）（欧洲克隆，目录号：ECS0180L），储存于-20°C
胰蛋白酶2.5％在HBSS（Euro Clone，目录号：ECB3051D）中，储存在-20°C
庆大霉素（Euro Clone，目录号：ECM0011B0），储存在4°C
HBBS没有钙和钙镁（Euro Clone，目录号：ECB4007L），储存在4°C
硫酸镁（MgSO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506），在室温下储存
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375），在RT存储
L-谷氨酰胺100x（200 mM）（Euro Clone，目录号：ECB3000D-20），储存于-20°C
Neurobasal TM 培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：21103049），储存于4°C
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P6407），储存于-20°C
B-27 TM 补充剂（50x），无血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：17504044）
液氮储存系统（Midsci，目录号：38K-CS200）
超纯水系统Milli-Q ® Direct（Merck Millipore，目录号：C85358）
解剖介质（见食谱）
破坏媒介（见食谱）
中和介质（见食谱）
神经元完全培养基（见食谱）
Neurostore培养基（见食谱）
聚D-赖氨酸涂料溶液（见食谱）

设备

10毫升移液器（EuroClone，目录号：EPS10N）
电池冷却器（Thermo Fisher Scientific，目录号：5100-0001）
水浴（Thermo Fisher Scientific，目录号：TSGP10）
Carl Zeiss TM Stemi TM 带LED照明的DV4系列立体显微镜（蔡司，产品目录号：0000001036143）
SL 8小型台式离心机（赛默飞世尔科技，目录号：75007220）
CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：51030992）
自动CO 2 交付单位（Vet-Tech.co.uk，目录号：AN044）
CO 2 商会（Vet-Tech.co.uk，目录号：AN045BR）
直剪112 mm（VWR，目录号：233-0011）
直剪式剪刀150 mm（VWR，目录号：233-0013）
解剖钳，超细尖，直（VWR，目录号：82027-402）
镊子直，钝105毫米（VWR，目录号：232-2111）
Bürker计数室，0.1 mm（VWR，目录号：HECH40423001）

程序

神经细胞制备和冷冻程序
1. 用过量二氧化碳（CO 2 ）对怀孕小鼠实施安乐死，用解剖剪刀取出子宫，从胚胎袋中取出单个胎儿。将胚胎放入100毫升培养皿中的10毫升无菌解剖培养基（见配方1）中，并将其置于冰上。
  注意：用70％的乙醇清洁腹部，然后用剪刀剪去皮肤，以免污染胚胎。
2. 用解剖剪刀剔除小鼠胚胎，去除皮肤和头骨，将大脑置于含有10毫升冷解剖培养基的无菌100毫米培养皿中。
  注意：使用尖锐的超细尖端解剖钳去除皮肤和颅骨。
3. 在立体显微镜下，使用超细尖镊子从小鼠脑中丢弃嗅球，小脑和中脑。然后去除脑膜和血管。
  注意：在脑膜切除过程中要小心。由于海马被脑膜包围，你可能会无意中移除并丢弃它。
4. 使用超细尖镊子解剖每个半球的海马和皮质。
  注意：海马可以很容易地识别为“香蕉”形状的组织。您还可以在Salazar中找到图像和解剖海马的程序等。，2017。
5. 将标本收集在装有冰的15毫升Falcon管中的12毫升冷处理培养基中。
  注意：在整个过程中将隔离的标本存放在冰上。在组织分离后立即使用超细镊子将切开的组织从培养皿移至15 ml Falcon管。
6. 在解剖过程结束时，让组织通过重力沉降在Falcon管的底部。用10ml新鲜的解剖培养基洗涤组织各3次，所述新鲜的解剖培养基预先在37℃在水浴中加热。
  注意：
  1. 从猎鹰顶部加入解剖培养基，让组织通过重力沉淀在猎鹰管的底部
  2. 在每次洗涤之间尽可能多地去除培养基，但在每个步骤中保持组织被培养基覆盖。使用10 ml移液器轻轻取出培养基。避免吸尘。＆nbsp;
7. 丢弃培养基，然后在15 ml Falcon试管中向组织标本中加入10 ml破碎培养基（参见配方2）。在37°C温暖15分钟，每隔2分钟倒入Falcon进行混合。
8. 让组织通过重力沉淀在Falcon管的底部。然后丢弃破碎培养基并用10ml中和培养基清洗组织（参见方法3）。
9. 让组织通过重力沉淀在Falcon管的底部。然后用预先在37℃加热的10ml新鲜解剖培养基洗涤组织三次。
10. 让组织通过重力沉淀在Falcon管的底部。丢弃培养基，然后向组织中加入5ml神经元完全培养基（见配方4），预先在37℃加热。
11. 用10ml移液管机械破坏组织，并将组织重悬15-20次或直至几乎组织块溶解。＆nbsp;
12. 在室温下，在15 ml Falcon台式离心机中以600 x g 旋转细胞10分钟。＆nbsp;
13. 用10ml移液管丢弃所有培养基并加入1ml Neuronal完全培养基。用P1000移液管重悬细胞10-20次。
  注意：避免形成细胞团块！如果残留一些组织碎片，让它通过重力沉淀在猎鹰的底部。然后收集含有所有解离细胞的培养基并将其转移到新的15ml Falcon管中。丢弃旧的15毫升管与组织碎片。
14. 加入4ml Neuronal完全培养基。
15. 计数神经细胞。平均产量是从E15.5小鼠胚胎获得的约8×10 6个细胞/皮质，2.5×10 5个细胞/海马体。细胞计数在Neuronal完全培养基中稀释少量细胞悬液（20μl）1：4，并在Bürker计数室中计数细胞。
  注意：稀释细胞有助于细胞计数。包括圆形和明亮的细胞，并在计数中排除不规则形状和暗的细胞。计算后，请记住应用稀释因子。
16. 温热的Neurostore培养基（参见配方5）和37℃的细胞冷却器在水浴中。
17. 计数后，将细胞在600 x g 下旋转10分钟。
18. 用10毫升移液管丢弃所有神经元完全培养基。
19. 用P1000移液管轻轻地将细胞沉淀重悬于1ml温热的Neurostore培养基中（约10次）。一旦除去所有细胞团块，加入温热的Neurostore培养基以达到所需的细胞浓度。
  注意：建议浓度为5 x 106 cells / ml Neurostore培养基。＆nbsp;
20. 在每个冷冻管中储存1毫升含有神经元的Neurostore培养基。
  注意：用P1000尖端等分细胞，5×106个细胞/冷冻。
21. 立即将电池冷却器移至-80°C。长期储存（一个月以上，一年以上）将液体储存在液氮罐中。
解冻程序
1. 温浴，解剖培养基和神经元完全培养基在37°C。
2. 将9毫升温热的解剖介质放入15毫升Falcon管中。
3. 将冷冻管移至37°C浴槽。通常，完全解冻需要2-3分钟。
4. 使用P1000移液管将含有细胞的1ml含有神经细胞的细胞加入15ml Falcon管中，使用温热的Dissection培养基。
5. 在600 x g 下沉淀细胞10分钟。
6. 丢弃媒体。
7. 用P1000移液器轻轻地将细胞重悬于1 ml温热神经元完全培养基中（约10次）。
  注意：重新悬浮直到细胞团块消失。
8. 加入4ml温热神经元完全培养基。
9. 计数细胞（如程序A-神经细胞制备和冷冻程序，步骤A15中所述）。
  注意：快速进行细胞计数以减少细胞压力。我们建议通过台盼蓝染色评估细胞活力。
10. 在Neuronal完全培养基中在适当的培养支持物上培养所需数量的细胞。
  注意：
  1. 我们建议使用Poly-D-Lysine涂层溶液进行涂层培养支持（参见配方6）。在室温下孵育o / n或在37°C孵育2小时，然后进行3次超纯水洗涤。
    对于12孔板，我们建议添加500μl/孔的Poly-D-Lysine涂层溶液。我们建议根据板孔的直径放大或缩小聚D-赖氨酸涂层的体积。
  2. 我们建议接种750-1,000个细胞/ mm 2 。混合适量的细胞和Neuron完全培养基以达到所需数量的细胞。在每个孔中加入正确体积的混合物。

数据分析

注意：我们参考原始出版物中报告的结果和数据（Pischedda 等。，2018。doi：10.3389 / fncel.2018.00081）。

为了验证冷冻保存皮层神经元的可能性，我们在冷冻和解冻时表征了E15.5小鼠皮质细胞。我们在-80℃下一周后解冻并接种培养物。在培养14天后，我们注意到在Neurostore中冷冻的培养物产生了复杂的过程网络（图1A）。
使用MTT测定，我们注意到在-80℃下存储在Neurostore中的新鲜培养物和培养物之间相当的生存力2周或4周（图1B）。在生理学上，神经元培养物通过触发细胞内途径来响应药理学刺激。冷冻保存的培养物和急性解离的培养物在AKT（蛋白激酶B）或ERK1 / 2（细胞外信号调节激酶1/2）磷酸化对FGFb（碱性成纤维细胞生长因子）或EGF（表皮生长因子）刺激方面的回答相当（图1F-1H）。冷冻保存程序可能会诱发氧化应激。然而，ROS（活性氧物质）产生在新鲜和冷冻保存的培养物之间产生类似的结果（图2C和2F）。
接下来，我们用表达GFP的病毒感染细胞并在DIV14分析培养物的形态（图3A）。神经突数，总长度和平均长度的分析未显示急性解离和冷冻保存的培养物之间的任何显着差异（图3B-3D）。
为了理解突触结构，我们在DIV14染色急性解离的2周和4周冷冻保存的突触蛋白和PSD-95培养物（图4A）。我们无法检测到所分析的实验组之间的任何主要差异（图4B-4D）。为了补充该分析，我们通过Western-blotting在DIV14的急性解离的和2周和4周的冷冻保存的皮质培养物中的突触前和突触后蛋白的表达进行了研究（图5A-5C）。
最后，我们通过全细胞膜片钳记录分析了急性解离的和2周和4周冷冻保存的皮质培养物的电学特征。所有参数的定量表明冷冻培养物和新鲜神经元之间没有显着差异（图6和表2）。

笔记

如果细胞以5×10 6 细胞/ ml Neurostore培养基的浓度储存，则对于皮质和海马神经元，Neurostore培养基中的神经元死亡率估计为20％-30％。解冻后计数细胞以减少不同神经元制剂之间的变异性是非常重要的。

食谱

解剖媒体
HBSS 1x
6mM MgSO 4
10 mM HEPES，pH 7.4
10μg/ ml庆大霉素
中断媒介
HBSS 1x
6mM MgSO 4
10 mM HEPES pH 7.4
10μg/ ml庆大霉素
0.25％胰蛋白酶
中和介质
HBSS 1x
6mM MgSO 4
10 mM HEPES，pH 7.4
10μg/ ml庆大霉素
10％FBS
神经元完全中等
Neurobasal 1x
B-27补充1x
0.5mM L-谷氨酰胺
10μg/ ml庆大霉素
Neurostore培养基（根据专利考虑，可根据要求提供。请联系Giovanni Piccoli教授 giovanni.piccoli@unitn.it ）
聚D-赖氨酸涂料溶液
重悬的聚-D-赖氨酸粉末在超纯水中，终浓度为50μg/ ml

致谢

资金来源：GP是Dulbecco Telethon Scientist（Grant No. TDPG00514TA）。该程序改编自Pischedda 等人，，2018。

利益争夺

Neurostore配方正在申请专利。

伦理

涉及动物的所有程序均由特伦托大学和国家机构（autorizzazione 793/2016-PR）的动物保护机构批准。

参考

Ichikawa，J.，Yamada，R.X.，Muramatsu，R.，Ikegaya，Y.，Matsuki，N。和Koyama，R。（2007）。从出生后大鼠海马中冷冻保存颗粒细胞。 J Pharmacol Sci 104（4）：387-391。
Ma，X.H.，Shi，Y.，Hou，Y.，Liu，Y.，Zhang，L.，Fan，W.X.，Ge，D.，Liu，T.Q。和Cui，Z.F。（2010）。慢速冷冻保存不同直径的神经干细胞球。低温生物学 60（2）：184-191。
Paynter，S.J。（2008）。冷冻保存神经细胞的原则和实际问题。 Brain Res Bull 75（1）：1-14。
Pischedda，F.，Montani，C.，Obergasteiger，J.，Frapporti，G.，Corti，C.，Rosato Siri，M.，Volta，M。和Piccoli，G。（2018）。原代小鼠神经元的低温保存：神经外膜冷冻保护介质的益处。前Cell Neurosci 12:81。
Salazar，I.L。，Mele，M.，Caldeira，M.，Costa，R.O.，Correia，B.，Frisari，S。和Duarte，C.B。（2017）。制备胚胎大鼠海马和脑皮层神经元的原代培养物。生物协议 7（18）：e2551。